摘要：“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin inresistantStaphylococcusaarews，MRSA）是诱发连续腹膜透析患者腹膜炎的常见细菌，且治疗困难。目前缺少MRSA腹膜炎动物模型。腹腔注射2x109?2x1010CFU/mL7组不同浓度的MRSA感染小鼠，观察小鼠死亡时间，测定肝脏与脾脏细菌定植量，进行肝、脾病理分析，确定适宜的建模浓度。研究发现，小鼠感染细菌浓度最小致死剂量为每只2x109CFU，最适建模浓度为每只1.4x109CFU。结果表明建立了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型，为MRSA致腹膜炎的致病机制研究、疫苗的研制提供实验基础
关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）；腹膜炎；小鼠模型
中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0054-05
EstablishmentofMousePeritonitisModelofMethicillinResistant Staphylococcus aureus
SUNQi，WANGXiang-yu，CHENShi-qi，SITULi-fang，ZHAOWei，WANCheng-song*
（BSL-3Laboratory，SchoolofPublicHealthandTropicalMedicine，SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515，Guangdong，China）
Abstract："Superbacteria11methicillinresistantStaphylococcusaureus（MRSA）isafrequentcauseofperi?tonitisincontinuousperitonealdialysis，andthetreatmentisdifficult.Meanwhile，MRSAperitonitisanimalmodelsarelacking.Itwasperformedwithmicespanidedintosevengroupsandgivenintraperitonealinjection2x109?2x1010CFU/mLofMRSA.Atthesametime，thetimeofdeathwasrecorded.Besides，thebacteriaamountofliverandspleenwasmeasuredandthepathologicalanalysisofliverandspleenwasperformed.Thenappropriatemodelingconcentrationwasdetermined.TheresultsshowedthattheminimallethaldoseoftheclinicalisolatedMRSAwas2x109CFUeachmouseandtheoptimalconcentrationofmodelingwas1.4x109CFUeachmouse.Themouseperitonitismodelofmethicillin-resistantstaphylococcusaureuswasconstruct?edsuccessfully，whichprovidedareliableanimalmodelfortheresearchofperitonitiscausedbyMRSAanddevelopmentofthevaccine.
Keywords：methicillinresistantStaphylococcusaureus（MRSA）；peritonitis；mousemodel
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：054?058）
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillinre?sistantStaphylococcusaureus，MRSA）自1961年在英国首次发现，全球范围内均有广泛报道。近年来由于抗生素的广泛使用，MRSA的分离率逐年增加，已成为医院感染最常见的致病菌[1、2]。由于MRSA耐药谱广、感染率高、病情严重、治疗困难，且多重耐药现象日益严重，一般只对万古霉素敏感，所以MRSA被称为“超级细菌”[3]。MRSA可引起菌血症、心内膜炎、肺炎等，同时也可导致腹膜炎[4]。由MRSA引起的腹膜炎主要发生在腹膜透析治疗中，腹膜透析是一种治疗急、慢性肾功能衰竭的重要方法，腹膜炎为其主要并发症，在腹膜透析腹膜炎患者中常可分离到MRSAI目前国内外缺少MRSA腹膜炎动物模型。本实验中用不同浓度的MKSA菌液腹腔注射小鼠，筛选建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型，为进一步研究MRSA致腹膜炎疾病提供了实验基础。
1材料与方法
1.1菌株
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA临床分离株，由南方医院检验科分离，本实验室保存。对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂耐药。
1.2实验动物
SPF级昆明种小鼠，雌性，6～8周龄，体质量（20±2）g，购自南方医科大学实验动物中心，实验过程中供给专用饲料及饮水，所有的试验程序符合美国NIH（NationalInstitutesofHealth）有关动物保护和利用的条例。
1.3菌株OD600-CFU标准曲线的建立
MRSA临床分离株复苏，37℃200r/min摇菌过夜，取菌液，LB固体培养基划线，37℃培养24h，挑取单菌落，再摇菌培养12h。
取摇菌后菌液增菌培养（1：100），2h后，取菌液测OD600，之后每0.5h测一次OD600，当OD600大于1时，停止测量。每次测量，取菌液1mL，离心弃上清，用无菌生理盐水洗涤2次，用1mL无菌生理盐水重悬。当大于1时，停止测量。 将重悬后的菌液倍比稀释（1：10）10次，每份稀释液1mL，取各稀释浓度0.1mL，加入无菌平皿后，倒入已熔化的LB培养基（45℃），与菌液混匀，待冷却凝固后，37℃培养24h，菌落计数。同一稀释浓度制两块平板。计算原菌液单位体积细菌数，其对数值lgCFU与稀释液对应的OD600值建立OD600-CFU标准曲线。
1.4感染菌液的制备
将小鼠随机分为8组，组号分别为1～8，每组10只小鼠。1～7组为实验组，第8组为空白对照组。
取MRSA临床分离株，过夜培养后，增菌培养（1：100）3h，测定OD600，根据OD600-CFU标准曲线确定菌液内活菌浓度，离心后弃上清，用无菌生理盐水洗涤2～3次再重悬，调整菌液浓度为2x109CFU/mL、6x109CFU/mL、8x109CFU/mL、1.2x1010CFU/mL、1.4x1010CFU/mL，1.8x1010CFU/mL、2x1010CFU/mL。
1.5MRSA腹膜炎小鼠模型的建立
将小鼠随机分为8组，组号分别为1～8，每组10只小鼠。1～7组为实验组，第8组为空白对照组。注射前12h禁食，自由饮水。
1-7组小鼠经腹腔分别注射2x109CFU/mL、6x109CFU/mL、8x109CFU/mL、1.2x109CFU/mL，1.4x1010CFU/mL、1.8x1010CFU/mL，2x1010CFU/mL的菌液每只0.1mL，第8组空白对照组每只注射0.1mL无菌生理盐水。实验后将小鼠放回笼内，给予食物及饮水。
1.6MRSA腹膜炎小鼠模型的评估
小鼠生存率：小鼠感染MRSA后分别于2h、4h、6h、8h、10h、16h、24h、48h、72h、95h、120h观察，记录小鼠死亡情况，绘制各感染浓度120h内小鼠生存曲线。
病理学检查：小鼠感染MRSA后，第24h、72h、120h颈椎脱臼处死，取肝脏与脾脏，生理盐水清洗，浸人4%多聚甲醛溶液中固定，H.E染色，显微镜下观察。正常小鼠做空白对照。
器官带菌量测定：感染MRSA小鼠，每24h取一只，颈椎脱臼处死，取肝脏与脾脏，研磨匀浆，倍比稀释（1：10）4次，取0.1mL稀释液加入无菌平皿，倒入已熔化LB培养基（45℃），混匀，培养基冷却凝固后，37℃培养24h，菌落计数。计算肝、脾细菌定植量。
2结果
2.1菌株OD600-CFU标准曲线
2h、2.5h、3h、3.5h测定菌液OD600，分别为0.185、0.576、0.929、1.256。活菌计数实验中，2h、2.5h、3h、3.5h菌液的第7次稀释浓度的平均菌落生长数分别为5.5个、17个、26个、36.6个。
每毫升菌液活菌数=平均菌落生长数x稀释倍数x10，计算得2h、2.5h、3h，3.5h菌液细菌量为5.5xlO8CFU/mL，1.7xlO9CFU/mL>2.6xlO9CFU/mL、3.65xl09CFU/mL。以OD600值为横坐标，以lgCFU为纵坐标，绘制菌株OD600-CFU标准曲线，见图1。
2.2感染后小鼠症状
不同剂量MRSA感染小鼠后，1组小鼠精神尚可，无明显变化。2～3组小鼠精神稍差，活动减少，于16h开始出现死亡，死前出现惊厥抽搐等表现，24h后小鼠存活率稳定。4?7组小鼠精神状态差、蜷缩不动、厌食、毛发杂乱蓬松、眼部充血，于8h开始出现死亡，死前出现惊厥抽搐等表现，24h后仍不断有小鼠死亡。空白对照组小鼠精神食欲等无明显变化。
2～7组未死亡小鼠于感染后体重下降，72h体重降至最低，%h开始回升。1组与空白对照组小鼠体重持续增加。
2.3小鼠生存率
小鼠注射不同剂量MRSA菌液，低浓度组小鼠无死亡，随着MRSA菌液浓度增加，小鼠死亡率不断升高。当菌液浓度达到1.4x1010CFU/mL时，24h小鼠死亡60%，120h小鼠全部死亡，认为该浓度适合建立小鼠模型。当菌液浓度达到2x1010CFU/mL时，小鼠在24h内全部死亡，每只小鼠注射0.1mL菌液，则该菌株的最小致死剂量为每只2x109CFU（图2）。
由图2可见，小鼠注射菌液后，第1组小鼠无死亡；第2组小鼠24h内死亡1只，至120h无新增死亡数；第3组小鼠24h内死亡2只，至120J，无新增死亡数；第4组小鼠24h内死亡4只，至120h共死亡8只小鼠；第5组小鼠24h内死亡6只，至120h10只小鼠全部死亡；第6组小鼠24h内死亡7只，至120h全部小鼠死亡；第7组小鼠24h内全部死亡。空白对照组小鼠无死亡。
2.4病理学检查
以1.4x1010CFU/mL浓度MRSA感染小鼠，于24，72，120h解剖小鼠并观察，可见小鼠腹腔有渗出液，腹膜不光滑、粘连，部分小鼠可见腹腔内有脓肿物形成。取小鼠肝脏与脾脏，H.E染色制作病理切片，显微镜下观察。镜下可见在24h～120h期间内，肝、脾组织渐进性坏死，细胞逐步出现变性坏死，组织结构溶解消失。24h镜下未见炎性细胞，72h与120h可见中性粒细胞浸润。24h肝脏与脾脏可见大量细菌团块，72h与120h细菌团块明显减少消失。
MRSA感染小鼠24h肝脏病理切片镜下观察，肝组织结构较空白对照组变化不明显，肝血窦小血管中以及肝实质细胞内可见大量细菌团块，未见炎性细胞浸润。72h肝脏病理切片可见肝组织局部出现点状坏死，核固缩，肝细胞肿大，可见炎细胞聚集。120h肝脏病理切片可见肝组织结构消失，破坏明显，未见明显肝索，肝细胞明显肿大，胞质疏松，可见散在肝细胞气球样变性，脂肪样变性。局部可见碎片状坏死，核固缩，核溶解明显，可见中性粒细胞浸润。图3A、B、C分别为第24h，72h、120h切片。 MRSA感染小鼠24h脾脏病理切片镜下观察，可见脾组织结构局部溶解消失，脾组织内存在大量细菌团块。72h脾脏病理切片可见睥组织坏死明显，出现空洞结构，可能为巨噬细胞吞噬作用造成。120h脾脏病理切片可见脾组织结构消失，细胞松散，炎性细胞浸润。图4A、B、C分别为第24h、72h、120h切片。
2.5器官带菌量测定
以8x109CFU/mL（第3组）、1.4x1010CFU/mL（第5组）、2x1010CFU/mL（第7组）浓度菌液感染小鼠，小鼠肝脏与脾脏均有细菌定植，在感染24h后定植菌量达到高峰，之后数日不断下降。对照组小鼠肝脏与脾脏均无细菌定植。见图5与图6。
3讨论
由于近年来抗生素的滥用，MRSA的检出率呈现逐年上升的趋势，已成为医院最常见的致病菌之一[1、2]，MRSA感染率高，感染后病情凶猛，不及时治疗有很大的死亡风险[3]。而MRSA耐药谱广且多重耐药现象日益严重，一般只对万古霉素敏感[3]，甚至近年来发现对万古霉素耐药的MRSA[6]，这无疑增加了MRSA感染的治疗难度，可见研制新型药物治疗MRSA感染的紧迫性与必要性。而研制MRSA的致病机理及其治疗药物，首先需要建立其感染动物模型，目前，国内外建立的MRSA小鼠模型主要分3种：脓毒血症全身感染模型、局部损伤模型如皮肤脓肿感染模型、肺部感染模型[7]。国外有学者建立了金黄色葡萄球菌小鼠腹膜炎模型[8]，但缺少MRSA小鼠腹膜炎模型。实际上，小鼠急性细菌性腹膜炎模型是临床研究的经典的动物模型之一，且MRSA亦会引起细菌性腹膜炎的发生：肝硬化患者由于腹水的产生易发生由MKSA引起的自发性腹膜炎[9]，肝移植等腹部手术后引起感染性腹膜炎[10]，而由MRSA感染引起的细菌性腹膜炎最常发生在终末期肾脏疾病与连续腹膜透析患者中[5]。腹膜透析作为晚期肾衰竭病人常用的治疗手段之一，由于其破坏了皮肤屏障功能，且腹膜导管缺乏免疫作用，故常在其出口处发生细菌感染，引发腹膜透析主要的并发症――腹膜炎[11]。最常见的导致腹膜透析相关腹膜炎的细菌是革兰阳性细菌，尤其是抗生素耐药的革兰阳性细菌正越来越普遍地成为腹膜透析相关腹膜炎的致病菌数据显示，1994?2005年间，香港进行腹膜透析治疗的2065个病例中，245个病例发生了腹膜炎（11.9%）：由金黄色葡萄球菌引起的腹膜炎有152例，占其中的62.4%，由MRSA引起的腹膜炎有45例，占所有腹膜炎病例的18.4%[13]。且MRSA引起的腹膜炎治愈率仅有7.7%，远低于其他细菌所致腹膜炎的治愈率[5]。对MRSA腹膜炎的致病机制及药物研究刻不容缓，而动物模型是研究的基础，因此建立MRSA小鼠腹膜炎模型是非常有必要的。
本实验中，我们对小鼠腹腔注射7个不同浓度的菌液以诱发小鼠腹膜炎，其中第1组小鼠5日内无死亡，说明该感染浓度过低，不足以引起小鼠腹膜炎的发生；第7组小鼠24h内全部死亡，故该组小鼠每只的注射剂量2x109CFU，是这株MRSA菌株的最小致死剂量（minimallethaldose，MLD）。考虑到小鼠模型常用于评价药品的药效，故感染的菌液浓度过低，小鼠死亡数过少体现不出药物的作用，而感染浓度过高，小鼠很快全部死亡，药物难以起保护作用，亦观察不到药物作用。而第5组1.4x1010CFU/ml组小鼠24h内死亡6只，达到了总数的半数左右，至第5日10只小鼠全部死亡，故以该浓度菌液感染小鼠后再用药物进行保护，可以明显地观察到药物的保护效力，故认为该浓度感染的小鼠建模最为合适。
本实验中，我们观察到小鼠在感染高浓度MRSA后，体重下降，之后逐渐回升。小鼠有典型的急性腹膜炎表现，解剖小鼠检查肝脏与脾脏发现，肝脏与脾脏呈渐进性损害，感染MRSA120h后细胞损害严重且有炎性细胞浸润，主要为中性粒细胞与巨噬细胞对小鼠肝脏与脾脏进行细菌定植量测定，发现感染24h时有大量细菌定植，之后细菌量逐步下降。以上表现符合细菌性腹膜炎的临床与病理表现。
MRSA小鼠腹膜炎模型的建立，为今后MRSA致腹膜炎疾病的致病机制的研究、治疗MRSA腹膜炎疾病的药物药效评价以及疫苗的研发等奠定了实验技术基础。
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