摘要：为了探究NP蛋白T细胞表位多肽NP67-74-KLH对流感通用疫苗4M2e-MAP免疫效果的影响，本研究将多肽NP67-74-KLH和4M2e-MAP添加完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂后免疫BALB/c小鼠，通过攻毒保护试验来评价免疫效果。攻毒以后小鼠体重变化曲线说明，联合免疫多肽疫苗NP67-74-KLH和4M2e-MAP的试验组小鼠体重变化趋势比单一免疫4M2e-MAP合成肽疫苗更加趋于平稳，并且联合免疫试验组小鼠体重恢复较快。荧光定量和肺部组织病理切片结果均表明，复合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干扰流感病毒在脏器肺中的复制并能够降低病毒对肺部的损伤程度，在抵抗病毒过程中可以产生有效保护。该研究为多肽疫苗联合应用以抵抗流感研发提供了较好思路。
关键词：禽流感；多肽疫苗；免疫效果
由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）各种亚型引起的禽类疾病综合征就构成了禽流感（Avian influenza，AI），几乎所有的野生和家养禽类都能感染[1]。AIV是引发流感爆发的主要病原，高变异性是该病毒的特性。从理论上讲，该病毒大约有 256 个血清亚型，而这些亚型之间又可进行重新组合，进而导致病毒的不断变异与宿主改变。二十一世纪初，对于盛行的禽流感，WHO已经向全世界提出了警示，大多数国家和地区也已经将禽流感作为第一监视对象，在我国为 A 类动物疫病。AI 对全世界养禽业的危害日益严重，香港在1997年首次从1名三岁儿童体内分离到一株 H5N1亚型禽流感病毒，表明 AI不仅可以感染禽类，还正在不断获得感染人的能力[2]。因此当前面临的艰巨任务是减少该病出现。解决这项艰巨任务最有用、最现实、最实惠的手段之一就是疫苗的研发与应用。疫苗的理想状态应是，在安全性良好的条件下，不但能激发机体的体液免疫，产生和病毒中和的抗体，更能充分激发机体的细胞免疫而使病毒清除机制得到有效发挥。禽流感预防控制的关键措施之一是疫苗的免疫使用，使用疫苗防治HPAIV最早的的国家就是中国[3]。
目前流感疫苗的保护效率大大被疫苗株和抗原变异所限制。流感病毒亚型众多，寻找一种具有交叉保护作用的疫苗仍然是抗流感的关键。
流感病毒的跨膜蛋白是M2 基质蛋白， 24 个氨基酸组成了该蛋白的胞外功能区（M2 ectodomain，M2e），该片段在不同亚型之间具有高保守性[5]。1933 年，初次分离到人流感病毒，在将近一个世纪内， M2e 在 A 型人流感病毒中只出现两个氨基酸位点的改变[6]。M2e疫苗诱导的保护性免疫应答主要是由抗体介导，但是理想的抗原应该同时具备激发体液免疫和细胞免疫的能力。NP蛋白由AIV基因组中的节段 5 编码，它同时拥有种群和型的特异性，在不同亚型病毒之间有高度保守性，该蛋白是诱导细胞毒性T 淋巴细胞（CTL） 反应的主要抗原，并且至少包括 3 个独立的抗原位点。NP蛋白上含有大量的 CD8+T 细胞识别的表位，诱导的细胞免疫可抵御不同亚型流感病毒的感染[4]。保护机体免受病毒攻击的主要机制是诱导机体的细胞免疫反应[7]。因此本研究旨在通过添加T细胞表位多肽NP67-74-KLH来增强抗原激发体液免疫和细胞免疫的能力，研究NP67-74-KLH+4M2e联合免疫的效果，为更深层次的流感病毒疫苗研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验毒株和动物
H9N2禽流感攻毒株（A/chicken/Henan/A1/08），由山东省农业科学院畜牧兽医研究所重点实验室保存。6～8 周龄 BALB/c 雌性小鼠，购自山东大学动物医院。
1.2主要试剂
弗氏完全佐剂（Freund’s Complete Adjuavant， FCA） 和弗氏不完全佐剂（Freund’s Incomplete Adjuavant， FIA），购自 SIGMA 公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。4M2e分支肽（4M2e-MAP）与多肽NP67-74-KLH，由上海生尔吉化生物技术公司合成，纯度为90%。引物序列：M2e（F1：5′-gtgcgcggatcc-3′；F2：5′-ctcgagttatcaagatct-3′）。
1.3攻毒试验
将40只6～8 周龄健康雌性 BALB/c小鼠随机分成4组，即：一组小鼠免疫4M2e-MAP合成肽，一组同时免疫4M2e-MAP合成肽和多肽NP67-74-KLH，其余两组小鼠作为对照组，分别免疫相同体积的弗氏佐剂和PBS。采用皮下接种的方式对小鼠进行免疫，共免疫2次，间隔2周。首免和二免剂量均为200 μL/只，且除PBS对照组外，其它三组首免辅以完全弗氏佐剂，二免辅以不完全弗氏佐剂。二免后两周进行攻毒，攻毒方式为滴鼻，免疫剂量为106.8 EID50/只。PBS免疫对照组的小鼠不进行攻毒。攻毒前一天对小鼠进行称重记录，攻毒后每天同一时间称取各组小鼠体重，比较体重变化，并在攻毒后观察记录小鼠的精神状态和计算存活率。
1.4Q-PCR检测肺脏病毒含量
攻毒的H9N2禽流感攻毒株是弱毒，对小鼠不产生致死，攻毒后3 d每组随机取3只小鼠用干冰麻醉处死，于无菌条件下取其肺脏组织放入500 μL 含有双抗的 PBS 中，同时加入无菌钢珠经碾磨机振荡碾碎，离心后取其上清。其中400 μL用于提取RNA，反转录为cDNA 后采用引物进行Real-Time PCR 检测。总反应体系20 μL：cDNA模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL、上下游引物（10 μmol・L-1）各0.5 μL、去离子水8 μL，混和均匀后在荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件：95℃预变性2 min；95℃，10 s；55℃，15 s；72℃，20 s；扩增45个循环；72℃延伸时采集荧光信号。以鼠β-actin基因作为内参基因校正试验的误差。每组样品的M2e基因 mRNA的精确拷贝数由荧光曲线的Ct值和标准曲线计算获得。 1.5肺组织病理学观察
于攻毒后第3 d每组随机取3只小鼠，无菌条件下取其肺脏，在10%甲醛溶液中进行固定，之后制作HE染色切片，在显微镜下观察组织切片病理变化。
2结果与分析
2.1小鼠体重变化
攻毒后观察小鼠的精神状态，每组差别不是很明显，都也没有出现死亡情况。小鼠体重变化如图1，在攻毒后的第4～6 d，除PBS对照组以外，每组小鼠体重均有下降，之后小鼠体重开始回升并逐渐趋于稳定状态，NP67-74-KLH+4M2e组小鼠体重回升趋势较4M2e组要快。
2.2肺脏病毒含量的测定
将反转录得到的cDNA 按实验室建立的实时荧光定量 PCR方法进行检测。公式计算待测组目的基因相对于空白对照组的表达差异倍数（图2）显示，佐剂攻毒组、4M2e组和NP67-74-KLH+4M2e组样品表达差异倍数分别为0.6783、0.4263、0.1233，佐剂攻毒组与4M2e组样品表达差异倍数显著高于NP67-74-KLH+4M2e组样品（P4M2e组>NP67-74-KLH+4M2e组，说明免疫多肽NP67-74-KLH+4M2e组的效果优于单独免疫4M2e组，NP67-74-KLH能提高4M2e的免疫效果。该方法较有效控制了扩增产物污染所致的假阳性，是由于试验中只有加样品时的一次开盖，完全闭管操作；肉眼分析结果被检测用的荧光值所代替，这就有效避免了人为因素干扰；定量结果由计算机软件自动化生成，其灵敏度比常规方法提高了2～3个数量级，达到了精准定量检测，易于检测的精确化。本方法检测cDNA，更灵敏地反映了AIV的感染情况和排毒情况。它具有灵敏性高、特异性强、操作简便、快速高效等优点，还可以进行多重扩增[8]。
荧光定量检测和肺部组织的病理切片结果均表明，各免疫组小鼠肺脏结构基本保持完整，NP67-74-KLH+4M2e组小鼠的肺泡间充血并且伴随少量的炎性细胞浸润，4M2e组小鼠肺泡充血，肺泡腔中有散在红细胞以及有纤维素样物质渗出。说明复合多肽（NP67-74-KLH和4M2e-MAP）能在一定程度上干扰流感病毒在脏器肺中的复制并能够降低病毒对肺部的损伤程度，在抵抗病毒过程中可以产生有效的保护。该研究为多肽疫苗的联合应用以抵抗流感的研发提供了较好的思路。
参考文献：
[1]Olsen B， Munster V J， Wallensten A， et al. Global patterns of influenza a virus in wild birds [J]. Science， 2006， 312：384-388.
[2]Claas E C J， Osterhaus A D M E， Rimmelzwaan G F， et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus [J]. The Lancet， 1998， 351： 472-477.
[3]Li Y， Shi J， Zhong G， et al.Continued evolution of H5N1 influenza virus in wild birds， domestic poultry， and humans in China from 2004 to 2009 [J]. J. Virol.， 2010，84（17）：8389-9397.
[4]Boon A C， de Mutsert G， Graus Y M， et al. The magnitude and specificity of influenza A virus-specific cytotoxic T-lymphocyte responses in humans is related to HLA-A and -B phenotype[J]. J.Virol.，2002，76（2）：582-90.
[5]Fan J， Liang X， Horton M S， et al. Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice， ferrets， and rhesus monkeys[J]. Vaccine， 2004， 22（23/24）：2993-3003.
[6]Fiers W， De Filette M， Birkett A， et al. A “universal” human influenza A vaccine[J]. Virus Res.， 2004， 103（1/2）： 173-176.
[7]Pertmer T M， Oran A E， Moser J M， et al. DNA vaccines for influenza virus： differential effects of maternal antibody on immune responses to hemagglutinin and nucleoprotein [J]. J. Virol.， 2000，74（17）：7787-7793.
[8]Walzinger F， Ebner K， Lion T. Delection and monitoring of virus infections by real-time PCR [J]. Molecular Aspects of Medicine， 2006，27：254-298.