摘要:通过灌胃正常大鼠甲状腺素片(含T3,T4)制造热证大鼠模型,正常大鼠给药7 d,采用RP―HPLC法检测大鼠肝脏组织中的ATP、ADP,AMP含量。结果表明。热证大鼠模型肝脏组织中腺苷酸含量与正常大鼠比较有显著差异。本方法简单,结果准确,验证了热证大鼠模型能量代谢加快。

关键词:反相高效液相色谱法;大鼠;肝脏;腺苷酸

中图分类号:0657.7+;R36 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2010)04-0954-02

甲状腺激素在体内具有广泛的生理作用,其中最主要的是促进组织氧化及产热。以往的研究表明。热证机体代谢旺盛。为探讨热证与机体能量的关系,我们采取灌胃正常大鼠甲状腺素片的方法制造热证大鼠模型,测定大鼠肝脏中腺苷酸含量,并与对照组比较。探讨热证机体与能量代谢的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器LC―10ATVP高效液相色谱仪:SPD-10AVP紫外可见分光检测器:Chromato―solutionlight色谱工作站;AUerge 64R型高速冷冻离心机;手动玻璃匀浆器:C0250型超声波清洗器。

1.1.2 试剂 ATPNa2、ADPNa2、AMPNa2对照品由Sigma公司提供,进口分装,纯度≥98%,批号为070601:磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、高氯酸均为分析纯(广东汕头市西陇化工厂);甲醇为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司):试验用水为娃哈哈纯净水;液氮由南昌生化试剂厂提供。

1.1.3动物与药品 成年健康SD大鼠32只,雌雄各半,体重(200±20)g。由江西中医学院实验动物中心提供。甲状腺素片,含药量(T3,T4)为40 mg,批号为070302(浙江尖峰药业有限公司)。

1.2方法

1.2.1 热证大鼠模型制造方法健康SD大鼠32只,随机分成两组,第一组为正常对照组(雌雄各半),灌胃给药0.5%CMC-Na;第二组为热证大鼠模型给药组(雌雄各半),灌胃给予甲状腺素片50mg/(kg・d),甲状腺素片以0.5%CMC―Na配制成所需浓度的混悬液。两组连续给药7 d,每天一次。光照:黑夜=12h:12 h,温度:(25+1)℃,湿度:(55+5)%。

1.2.2大鼠肝脏组织样品处理大鼠断头处死,迅速取肝脏组织于液氮中保存,测定时称取0-3 g肝脏组织于玻璃匀浆器中,加入3 mL预冷的0.6 mol,L高氯酸,在冰水浴中迅速制成匀浆液。匀浆液4℃、8 000 r/min离心10 min。精密取上清液1 mL,用1 mol/L的磷酸氢二钾0.7 mL中和至pH值6.5左右。再4℃、8 000 r/min离心10min。取上清液经0.45 tJ,m滤膜过滤。即得肝脏组织样品溶液。1.2.3 RP-HPLC分析条件Hvpersil C18色谱柱(4.6mmx250mm,5μm);C18预柱;流动相为pH值6.0的75 mmol/L KH2P04-K2HP04缓冲溶液;流速为0.7 mL/mln;柱温为25℃:检测波长为254nm;灵敏度为0.01AUFS;进样量为10μL。

2 结果与分析

2.1定性试验

精密称定对照品ATP 5.0 mg、ADP 6.0 mg、AMP 4.0mg,置于同一50mL容量瓶中,用流动相溶解并定容,摇匀,配制成腺苷酸混合对照品溶液。精密称取对照品ATP 12.4 mg、ADP 9.8 mg、AMP 6.2mg,分别置于50 mL容量瓶中,用流动相溶解并定容,摇匀,ATP、ADP、AMP浓度依次为248μg/mL、196μg/mL、124μg/mL,作为储备液,置4~C冰箱保存。测定时取经处理后的肝脏组织样品在上述色谱条件下进样10μL作色谱分析,ATP、ADP、AMP保留时间分别为7.3、8.5、14.3 min,峰形良好,无杂质峰干扰测定。定性结果如图1。

2.2线性关系

回归分析结果表明ATP在1.575~252 txg/mL范围内.ADP在1.275-204 μg/mL范围内,AMP在1.325-212μg/mL范围内,线性关系良好。相关系数分别为0.999 8、0.999 3、0.999 4。ATP、ADP、AMP的回归方程分别为:A=8.176xl(PC-4.928x103;A=1.033x104C-2.815xl(P;A=1.631x104C-5.259x104。

2.3精密度试验

在上述色谱条件下.精密吸取腺苷酸混合对照品溶液,在同一天连续进样6次,测定ATP、ADP、AMP的峰面积,其RSD分别为2.0%、2.6%、2.0%。

2.4加标回收率试验

称取大鼠肝脏组织1.2 g,平均分成4份。一份作本底值,另外3份加入标准品,计算加标回收率。肝脏组织平均加标回收率如下:ATP为95.2%.ADP为94.5%,AMP为93.6%。

2.5肝脏组织中ATP、ADP、AMP含量变化

根据上述方法测定大鼠肝脏组织中ATP、ADP、AMP的含量。结果表明与对照组比较,热证大鼠模型给药组ATP、ADP、AMP含量均有提高,且有显著性差异(P< 0.05),结果如表1。

3 小结

试验数据表明热证大鼠模型给药组的ATP、ADP、AMP含量均高于正常对照组且具有显著性差异(P< 0.05)。

据文献报道,在甲状腺激素作用下,机体物质代谢增加,相应的能量代谢也会增加,一般直接反应就是体温升高,体重下降,饮水增多,生理状态下,机体的寒热可反映能量生成及利用的平衡关系,其中主要是ATP的生成、利用及产热作用,故对热体中ATP活性高低的研究及其他指标含量的比较研究可从一方面反映热证与能量代谢的关系。

本试验采用RP-HPLC法测定大鼠肝脏组织中腺苷酸含量,操作简单,快速,重现性好,定性可靠。定量准确。本试验研究表明甲状腺激素可以提高机体的能量代谢,制造的热证大鼠模型能量代谢水平有加快的趋势,有关热证大鼠模型与能量代谢的作用机理及其能量代谢指标的选择有待进一步研究。