摘要：分别应用紫杉醇荧光和免疫荧光标记法显示hUVECs（human umbilical vein endothelial cells， hUVECs）在不同切应力加载下微管骨架的装配动态及初级纤毛的形态发生。结果表明，以梯度切应力加载24h，随着切应力增大，细胞由梭形逐渐变圆，长宽比降低，胞质微管向细胞核周围集结并发生装配；14dynes/cm2切应力加载48h后，微管向切应力方向延伸导致细胞呈长梭型，微管停止装配；以15dynes/cm2切应力加载28h后，纤毛基体在细胞表面的定位不可见，纤毛微管解聚；再以1dynes/cm2切应力加载18h，又可观察到纤毛基体在细胞表面的重新定位。因此，切应力作用可诱导hUVECs形态变化，该变化经历了微管骨架的解聚、向细胞核方向聚集及重新装配过程；此外，切应力能够影响初级纤毛的形态发生，该现象可能导致了初级纤毛在心血管 系统中的分布不均，并为“纤毛疾病”的治疗提供新的思路。关键词：人脐静脉内皮细胞；切应力；微管类细胞骨架；初级纤毛；纤毛发生中图分类号：Q245 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0013-06
Changes on Morphology and Ciliogenesis of hUVECs Loaded on Different Flow Shear Stress
LI Xiu-mao1， SHENG Xin2*， GUO Peng-fei2， CHEN Cheng-he2， HE Lei2
（1. Cardiothoracic Surgery Department， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Zunyi 563000， Guizhou， China；2. Department of Biochemistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563000， Guizhou， China）
Abstract： The microtuhular cytoskeleton assembly dynamics and ciliogenesis of human umbilical vein en-dothelial cells （hUVECs） loaded on different flow shear stress were separately visualized by using FLUTAX direct-flurescent labeling and immunofluorescence with anti-y-tubulin antibody. The results demonstrated that when the cells were loaded on increased gradient flow shear stress for 24 h， the cell shape hecame spherical from spindle， the aspect ratio reduced， and the microtubules in cytoplasm gradually gathered around the nucleus and initiated assembly. When some cells were loaded on flow shear stress of 14 dynes/cm2 for about 48 h， the microtubules elongated to the direction of the flow shear stress and accomplished assem-bly， and the cell shape became elongated and spindled. The basal bodies of primary cilia could not he ob-served on the cell surface and microtuhules of cilia were depolymerased as cells were loaded on laminar shear stress （15 dynes/cm2） for 28 h， but interestingly， the basal bodies appeared if cells were further treated with flow shear stress of 1 dynes/cm2 for 18 h. Therefore， flow shear stress can induce changes of cytomor- phology of hUVECs which undergo a process of depolymerization， elongated and reassembly of microtuhules. Moreover， it also influent the ciliogenesis， which may result in disproportion distribution of the primary cilia in cardiovascular system， and provide new ideas for the treatment of ciliopathies.
Key words： human umbilical vein endothelial cells （hUVECs）； flow shear stress （FSS）； microtuhular cy-toskeleton； primary cilia； ciliogenesis（Life Science Research， 2015 ， 19（1）： 013～018） 近年来，基于局部血流动力学与心血管疾病发生、发展的密切关系，血流切应力（flow shear stress， FSS）对血管内皮细胞（vascular endothelial cells， VECs）的形态及功能影响成为研究热点[1，2]。人们发现，体内较高切应力区域的VECs多为椭圆形，而低切应力区域多为多角形[3]。体外实验证实，在切位力作用下，细胞倾向于向切应力方向定位[4]。大多数的研究认为切应力对细胞形态变化的影响主要源于肌动蛋鹊闹刈[5]，相比之下有关微管类细胞骨架在此过程中的作用还缺乏深入的研究在细胞功能方面，高速、单向的血流所产生的层流切应力（≥15dynes/cm2）对VECs具有抗血栓、抗增生、抗炎症等作用，而低速、摆动或回旋的血流所产生的低切应力（1 材料与方法
1.1 材料
hUVECs购于中国典型培养物保藏中心，传代培养。
1.2 方法
以平行平板流动小室（parallel-plate flow chamber， glycotech）为流室，以数字精密蠕动泵为动力，并以真空泵维持系统密封性建立起内皮细胞体外流动培养系统（见图1）[12]。直接荧光采用本实验室改进的FLUTAX方法[13]，主要步骤如下：1）分别将静置和切应力加载培养的hUVECs以4%的多聚甲醛中固定30min，0.01mol/LPBS清洗3次，每次5min；2）1μmol/LFLUTAX2（Molecular Probes）染色10min，0.01mol/LPBS漂洗5min；3）以防猝灭剂封片，Olym-pus IX71荧光显微镜观察、拍照。
免疫荧光采用本实验室改进的方法[14]：1）分别将静置和切应力加载培养的hUVECs以4%的多聚甲醛中固定30min，0.01mol/LPBS清洗3次，每次5min；2）以0.2%TritonX-100覆盖于细胞上，室温下处理2min；0.01mol/LPBS清洗3次，每次5min；3）以PBS-3%BSA清洗3次，每次5min；4）以20μL1：1000稀释的抗y-微管蛋白抗体一抗覆盖于细胞上，4℃下孵育过夜，以PBS-3%BSA清洗3次，每次5min；5）以20μL1：100稀释的FITC标记的二抗覆盖于细胞上，室温下孵育45min，以PBS-3%BSA清洗3次，每次5min；6）以防粹灭剂封片，OlympusIX71突光显微镜观察、拍照。
细胞周期检测方法参照试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司，Cell Cycle Detection Kit）说明进行，步骤如下：1）细胞以PBS洗去培养基，加入无EDTA胰蛋白酶消化，离心收集；2）PBS清洗3次；3）制备的单细胞悬液用体积分数为70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；4）加100μLRNaseA37℃水浴30min，再加入400μLPI染色混匀，4℃避光30min；5）以正常细胞作对照，在30min内进行流式细胞仪检。
2结果
2.1梯度切应力加载24后hUVECs微管类细胞骨架及细胞形态变化FLUTAX为紫杉醇的荧光衍生物，其相对分子质量小，易透过细胞膜并特异性结合于αβ-微管蛋白二聚体，能够清晰地显示微管类细胞骨架在细胞中的分布和走向，进一步通过荧光的细胞定位和强度对细胞形态、微管的聚集和走向进行定性和定量分析：本研究分别对hUVECs进行了梯度切应力（0-14dynes/cm2）加载作用，并以FLUTAX法对微管类细胞骨架进行了染色和观察（图2）。结果显示，静置培养（0dynes/cm2）时，hU-VECs的细胞形态主要呈梭形或三角形，胞质微管以细胞核为中心向多个方向延仲，细胞长宽比较大，排列无明显的方向性（图2A），且细胞核内部荧光染色较浅（图2白色箭头所示）；通过荧光强度可见微管在胞质中的分布均匀，除个别处于形态发生时期的细胞外，未见明显的微管装配现象发生。随着切应力的增大，细胞由梭形逐渐变圆，细胞长宽比逐渐降低，胞质微管逐渐聚集到细胞核周围，荧光在细胞核周围明显增强，大部分细胞可观察到微管在此集结和装配（图2B-H），其中，以14dynes/cm2加载24h最为明显。当14dynes/cnr加载48h后，在部分区域可观察到微管骨架向切应力方向延伸使整个细胞呈长梭型；绝大多数细胞荧光染色较浅，微管装配停止（图3B）。
2.2 层流切应力加载12～28h后hUVECs初级纤毛发生
为探索hUVECs的纤毛发生和定位情况，本实验以抗微管蛋白抗体标记纤毛基体，并以DAPI标记细胞核；分别观察加载同一层流切应力（15dynes/cnr）0、12、28h，以及在28h之后改变切应力大小为1dynes/cm2继续加载18h.γ-微管蛋白在细胞表面的定位情况定位于细胞核周围的红色亮点为纤毛基体所在（图4箭头所示）结果表明，在静置培养的细胞表面存在初级纤毛的定位，但纤毛多定位于细胞中央（图4A、A〃）；随着切应力加载时间的逐渐增大，在细胞核周围可观察到微管在某一区域逐渐集结和装配，纤毛基体定位逐渐偏离细胞中央，与细胞质延伸方向一致（图4B）当以层流切应力加载28h时，大多数细胞观察不到纤毛基体在细胞表面的定位，组成纤毛的微管发生了解聚（图4C、C〃）；但当细胞再加载1dynes/cm2切应力18h后，又可观察到纤毛基体在细胞表面的重新定位，且位于细胞质延伸区（图4D、D〃），表明在较低切应力加载下细胞又发生了微管的重新装配并形成了新的纤毛。另外，为检测FSS对细胞生长及周期的影响，通过细胞周期检测试剂盒对细胞层流切应力加载28h后再加载1dynes/cm2切应力18h的细胞进行了PI染色和流式细胞术检测。结果表明，与对照组相似，大部分细胞处于G0、G1期且未见S期及凋亡细胞，但处于G2、M期的细胞较对照少，几乎看不到，细胞生长处于平台期（图5），源于加载切应力的近48h期间细胞基本长满载玻片使分裂期细胞相对较少。由此可见，在长时间加载切应力期间，细胞的生长和周期并未受到影响。 3讨论
3.1 切应力可诱导hUVECs微管类细胞骨架发生重新装配并导致细胞形态变化
hUVECs在静置培养条件下，细胞融合后呈鹅卵石状，细胞形态为梭型或多角形，细胞的长宽较为分明[15]。早在20世纪90年代，就有报道显示血流动力学能够使细胞形态由鹅卵石状转变为长梭型[14]，这一变化主要来源于细胞骨架重构[16]，最新的研究也显示，对内皮细胞加载适当的切应力可导致细胞逐渐变为长梭型，其长轴与血流切应力方向一致，且切应力越大所需要的加载时间相应越短[17]。而本实验的研究结果表明，内皮细胞骨架的改变并非直接变为长梭型，而是随着切应力的增大，经过了一个过渡状态即圆形，再逐渐向切应力方向伸展，且细胞骨架可观察到明显的装配阶段：因此推测，在切应力诱导细胞形态变化过程中，细胞骨架首先发生了解聚，再进一步向切应力方向重新装配成长梭型。同时，我们也注意到按照“铺路石”样排列紧密的细胞在切应力作用下更容易形成钝圆的形态，而非长梭型，由此推测，细胞之间没有间隙的状态下，细胞形态的改变受到了彼此的约束，切应力的诱导作用更倾向于导致细胞骨架的解聚.并向细胞核周围聚拢.而要使细胞骨架按照相应的作用力方向重新排列需要电大的切应力作用更多的时间，而这样的切应力大小是体内静脉血流所不能达到的，因此，在活体静脉管壁中的内皮细胞形态不易形成按照血流方向的梭型排列方式。综上所述，切应力作用是可以诱导hUVECs发生形态变化的，这一变化的发生经历了微管类细胞骨架的解聚、向细胞核方向聚集以及重新装配等过程。
3.2切应力可影响hUVECs初级纤毛在细胞表面的定位和发生
纤毛的形成过程被称为纤毛发生，涉及纤毛基体的定位和纤毛轴丝装配。通常情况下，纤毛发生受到细胞周期的调控[18]。然而近年来的研究显示药理学作用或外界环境的变化均能够影响纤毛的发生或长度，这种现象不依赖于细胞周期，属于自我装配过程。更有直接证据显示来自于细胞基质的机械信号能够快速调节腱细胞纤毛长度[19]。在心血管系统中，初级纤毛在动脉及胚胎心脏内表面的分布也与血流模式相关[20]，但血流模式是否能够调节初级纤毛的发生及长度变化还未见报道。本实验表明hUVECs初级纤毛在15dynes/cm2切应力作用28h以上将发生解聚，该切应力大小接近于体内正常血流产生的层流切应力，因此初级纤毛较少出现于正常血流区域血管内皮细胞表面；此外，当再次以低切应力（1dynes/cm2）诱导细胞18h后，可观察到纤毛装配的发生，而该过程与细胞周期无关。因此，本研究进一步证实了外界机械作用力能够影响初级纤毛的形态发生过程，该现象可能导致了初级纤毛在心血管系统中的分布不均。
3.3外界环境对纤毛发生的影响为纤毛疾病的治疗提供新思路
初级纤毛作为机械和化学信号传感器，广泛存在于上皮、软骨、成纤维以及神经元等多种细胞表面，大量的研究表明初级纤毛能够通过调节多条信号通路（如Hh、Wm等）参与细胞的增殖、迁移、分化及动态平衡等过程[18]。纤毛结构和功能异常将导致一系列疾病的发生，包括多囊肾病（polycystickidneydisease，PKD）、肾结核、Bardet-Biedl综合征等[21]。此外，由于新纤毛基体的定位方向决定了细胞乃至胚胎发育的极性方向[22]，初级纤毛的缺失将导致细胞乃至胚胎极性分化的随机性[23]。因此，纤毛结构的完整性及正常的纤毛发生对维持机体正常功能和发育具有不可忽视作用，而本研究的结果证实了一定的外界机械作用力可影响初级纤毛的形态发生，进一步探索该现象的发生机制将为纤毛相关疾病的治疗提供新的思路
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