摘 要：为了开发杂粮酵素发酵剂菌种，以淀粉酶活力为评价指标，从杂粮发酵酸面团中分离、筛选具有高产淀粉酶活力的酵母菌，并且利用分子生物学方法鉴定其菌种分类。研究结果显示，从杂粮酸面团中共分离出36株酵母菌，其中NCCC7和NCCC31菌株淀粉酶活力最高，分别为453.13U/mL和463.79U/mL，经26S rDNA鉴定，NCCC7和NCCC31均为酿酒酵母菌种。
关键词：杂粮酵素；酿酒酵母；淀粉酶
中图分类号 S816.7 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）08-25-03
Abstract：In order to develop coarse cereals enzymes starter，amylase activity as the evaluation index，high amylase producing yeast were isolated and screened from coarse cereals sourdough，and classified by molecular biology techniques. Research results showed that 36 strains of yeast were isolated from coarse cereals sourdough，the amylase activity of NCCC7 and NCCC31 strains was the highest，453.13U/mL and 463.79U/mL respectively，and both NCCC7 and NCCC31 strains were identified as Saccharomyces cerevisiae by 26S rDNA gene.
Key words：Coarse cereals enzymes；Saccharomyces cerevisiae；Amylase
酵素是有益微生物通过发酵食材而产生的富含多种生物活性酶的健康保健食品，近年来越来越受到消费者的青睐[1]。市场中现有酵素食品原料多集中于果蔬、菇类、中草药等非粮食食材[2-3]，粮食中只有糙米进行了酵素食品的开发[4-5]，并获得了极大的成功，然而杂粮酵素食品开发尚属空白，因此杂粮酵素食品及其保健品的研究开发具有良好的市场前景和应用价值。本研究从自然发酵杂粮酸面团中分离、筛选和鉴定高产淀粉酶的酵母菌，进而期望为杂粮酵素食品的开发提供优良的酵母菌菌种资源。
1 试验材料
1.1 原料 小米、黑米、薏苡、荞麦、芸豆、高粱，市售。
1.2 试剂及培养基 酵母菌基因组提取试剂盒、Taq酶，购自上海生工生物工程有限公司；淀粉酶试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；碘液、可溶性淀粉等均购自哈尔滨无限峰科技有限公司。YPD培养基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%。YEPD培养基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，琼脂2.0%。酵母菌筛选培养基：酵母提取物0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂2.0%。
1.3 主要仪器设备 压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司生产；生化培养箱，上海姚氏仪器设备厂生产；全温振荡培养器，上海智诚分析仪器制造有限公司生产；精密分析天平，上海跃进医疗器械厂生产；台式离心机，武汉世纪超杰实验仪器有限公司生产。
2 试验方法
2.1 检测方法 淀粉酶活力采用分光光度计检测方法，具体操作按照南京建成生物工程研究所的淀粉酶试剂盒说明书进行。
2.2 自然发酵杂粮面团的制作方法 将6种杂粮粉各100g进行混合，边混合边加入400mL水，搓揉成面团，温度28℃和湿度75%条件下，在醒发箱中发酵5h。
2.3 酵母菌的分离纯化 取1g杂粮发酵面团，用无菌水梯度稀释后涂布于YEPD培养基平板，28℃培养48h后，多次分离划线得到单菌落，接种于YPD培养基中28℃培养24h后，加甘油保存于-80℃冰箱，备用。
2.4 高产淀粉酶酵母菌的筛选 将分离和纯化后的菌种涂布于筛选培养基上，28℃培养24h后加稀碘液，静置5min后观察透明圈，测量透明圈直径大小。测量后将透明圈较大的单菌落接种于YPD培养基中，28℃培养48h后检测淀粉酶活力。
2.5 酵母菌菌种的分子生物学鉴定 以待测菌种的基因组DNA为模板，以NL-1（5′-GCATATCAATAAGCGGA GGAAAAG-3′）和NL-4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）为引物进行酵母菌26S rDNA基因D1/D2片段扩增。待测菌种的基因组DNA采用酵母菌基因组提取试剂盒制备。PCR扩增条件为94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行测序。测序得到的26S rDNA基因D1/D2片段序列利用BLAST进行检索，找到序列同源性最高的已知菌种，选取该菌属内有代表性的多种模式菌株26S rDNA基因D1/D2片段序列，利用MEGA6.0软件[6]中Neighbor Joining法构建系统进化树。利用Bootsdrap1000次检验进化树置信度[7]。
3 结果与分析
3.1 酵母菌分离和纯化 通过梯度稀释、涂布平板和多次划线分离纯化，共得到疑似酵母菌36株，结果如图1所示。
3.2 酵母菌产淀粉酶能力 分离纯化酵母菌株的透明圈测量结果见表1。由表1可知，在分离的36株酵母菌中，只有4个菌株没有透明圈，其余32个菌株均有不同大小的透明圈出现，这表明杂粮发酵酸面团环境下分离的酵母菌大多数都具有淀粉酶合成能力，其中5株酵母菌透明圈大于4mm。 将透明圈大于4mm的5个酵母菌菌株进行淀粉酶活力的测定，实验结果如表2所示。由表2可以看出，NCCC7和NCCC31菌株产淀粉酶能力最强，淀粉酶活力分别可达453.13U/mL和463.79U/mL，其余3株酵母菌也表现出较强的产淀粉酶能力。
3.3 酵母菌菌种分子生物学鉴定 对产淀粉酶能力最强的NCCC7和NCCC31菌株进行26S rDNA基因D1/D2区域的PCR，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图2。由图2可知，NCCC7和NCCC31菌株均扩增出1条约500bp的目的条带，与预期酵母菌26S rDNA基因D1/D2区域片段大小一致，可用于后续测序实验。
NCCC7和NCCC31菌株的26S rDNA基因D1/D2区域DNA片段经上海生工生物工程有限公司测序，测序结果经NCBI网站的BLAST软件比对，获得相似性最高的菌种均是酿酒酵母，序列相似性分别为98.9%和99.2%。2个菌株的26S rDNA基因D1/D2区域DNA序列与其他模式菌株26S rDNA基因D1/D2区域DNA序列的系统进化树分析结果见图3。由图3可知，NCCC7和NCCC31菌株26S rDNA基因均与酿酒酵母聚类为一支，亲缘关系最近，同时与奇异酵母菌没有聚类为一支，表明亲缘关系较远。因此，根据序列比对分析和系统进化树分析，NCCC7和NCCC31菌株均属于酿酒酵母菌种，因此将其命名为酿酒酵母NCCC7和NCCC31。
4 结论
本研究从自然发酵的杂粮酸面团中分离纯化出36株酵母菌疑似菌株，其中大多数菌株具有产淀粉酶能力[8]。测定了5株酵母菌的淀粉酶活力，其中NCCC7和NCCC31产淀粉酶活力最高，分别为453.13U/mL和463.79U/mL。之后利用分子生物学方法对NCCC7和NCCC31的26S rDNA基因进行了菌种鉴定，根据序列比对分析和系统进化树分析，结果显示，NCCC7和NCCC31均为酿酒酵母菌种，可以用于今后杂粮酵素食品开发的候选发酵剂。
参考文献
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