腰椎间盘突出症(LDH)是脊柱外科疾病中发病率最高的一种疾病， 一个人一生中发生下腰痛的概率大约是80%，而其中20%～30%是因LDH 引起的。其中炎症介质在神经根病变中起着重要的作用， 炎症介质可以诱使人体的神经纤维组织产生炎性变化、超敏化及神经纤维的脱髓鞘改变; 这些炎症介质还使得神经根及相邻部位的神经纤维感受器处于兴奋状态。从而成为LDH 神经根性疼痛的重要原因之一。1990 年Saal 等在LDH 患者手术摘除的髓核中，发现磷酯酶A2(PLA2)活性显著升高，证实了椎间盘组织中PLA2炎症介质的存在。随后炎症介质在临床中引起人们的注意。1995 年Ozaktay 等通过实验在兔子腰关节囊及附近组织中注入PLA2，解剖后发现注射部位出现了炎症及神经毒性反应， 说明在突出的椎间盘髓核中PLA2 具有高度引起局部炎症的特性。现代有研究表明，当人体的椎间盘发生退变时，可在退变的组织中检测到多种炎症细胞因子， 如肿瘤坏死因子- (TNF-)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)等。而TNF 是在炎症产生中最早出现和起到重要作用的炎症介质。
TNF 可诱发机体产生中性粒细胞及淋巴细胞， 并能促进其他炎性细胞因子的聚集和分泌。这些炎症介质可引起细胞的毒性作用，从而释放过氧化物酶、NO 等物质。这些物质会导致软骨终板细胞的损害，使得椎间盘软骨细胞溶酶体丧失稳定性， 进而导致细胞膜脂类代谢、糖代谢发生紊乱，最终引起软骨终板细胞出现坏死和钙化， 这种变化会使退变的椎间盘产生严重的营养障碍， 从而加速椎间盘组织的退变步伐。本实验通过观察枳壳甘草汤对大鼠腰椎间盘突出模型髓核中PLA2 活性及其对IL-6、TNF- 的影响，为枳壳甘草汤提供实验依据。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验
动物选取3 月龄SPF 级SD 雄性大鼠90只，体质量(20020) g，由苏州市中药研究所提供。动物实验环境：清洁级，温度控制在22 ℃左右，湿度在65%左右。实验过程中完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》标准。
1.2 药物
与试剂中药饮片：枳壳甘草汤组成为枳壳10 g，甘草6 g，当归10 g， 丹参10 g， 三棱10 g， 莪术10 g， 牵牛子丑5 g ( 枳壳批号为20150202; 甘草批号为20150123; 当归批号为20150321; 丹参批号为201500821; 三棱批号为20150530; 莪术批号为20150309;牵牛子批号为201500409，均购自苏州春晖堂饮片厂)。加冷水500 mL，浸泡30 min，煮沸后煎30 min，取汁200 mL;再加水300 mL，煎30 min，取汁200 mL，两次相兑，并浓缩成1.5 g/mL 煎剂，保存于恒温冰箱中备用。吲哚美辛胶囊(25 mg/粒，苏州第三制药厂有限责任公司，批号：150409);PLA2 Elisa 测定试剂盒(批号：201601，南京建成生物科技有限公司);戊巴比妥钠(批号：101087，Sigma 公司);注射用青霉素G 钠(0.48 g，80 万U，山东鲁抗医药股份有限公司);红霉素软膏(0.5%，批号：150107，新乡华青药业有限公司);TNF-(货号Sc-374433， Santa 公司);IL-6(货号Sc-1265，Santa 公司);抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(货号：K5007，Dako Denmark A/S 公司);血清(驴血清)(目录号：MP-7401，VECTOR-LAB 公司)。
1.3 主要仪器
Labsystems Finnpipette 100 L 单道移液器(南京建成生物科技有限公司);Thermo 50L 8道移液器(南京建成生物科技有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);华东电子DG5033A酶标仪(南京华东电子集团医疗装备有限责任公司)。
1.4 模型制备
1)椎间盘的获取：将SD 雄性大鼠90 只，体质量(20020) g，经2%戊巴比妥钠(30 mg/kg) 腹腔注射麻醉并固定大鼠四肢， 用组织剪剃除大鼠背部体毛。常规消毒后铺无菌单，并用橡皮筋扎紧大鼠尾部。操作员在无菌环境下每只大鼠取第3、4 尾椎的椎间盘两个(椎间盘包括上下软骨终板)。取出的椎间盘采用10 mL 针头刺破椎间盘正中的纤维环，暴露出髓核，从而造成成破裂形态，放在生理盐水中备用。
2)椎间盘的埋植：碘伏常规消毒背部，取后背正中切口，以L5 棘突为中心，长约2 cm，切开皮肤、肌肉、将椎间盘植入肌肉层，随后逐层缝合，肌肉注射青霉素钠80 万U， 伤口处涂以红霉素眼膏。后将大鼠放入笼中常规饲养。
3)术后管理：造模成功，待大鼠麻醉苏醒后，放置饲养笼中，22 ℃温室饲养。术后5 d 连续使用青霉素钠80 万U 肌肉注射预防感染。
1.5 分组及给药
将90 只SD 雄性大鼠采用随机数字表法，随机分为3 组，每组30 只，即模型组、中药组(枳壳甘草汤)、西药组(吲哚美辛)。分组后，根据人和动物体表面积折算的等效剂量比率表 计算得出给药剂量后灌胃给药。中药组予枳壳甘草汤煎剂9.1 mL/kg，造模前1 h 灌胃给药，造模后灌胃，每日1 次，共5 d。西药组予吲哚美辛7.5 mg/kg， 造模前1 h 灌胃给药，造模后灌胃，每日1 次，共5 d。模型组予0.9%氯化钠注射液灌胃，按照与中药相同剂量和方法给药。
1.6 观察项目
1)髓核中PLA2 活性：于术后7、14、28 d 各组分别取6 个移植髓核标本，-80 ℃下保存。样本在60 ℃水浴30 min 后冷却，置4 ℃冰箱备用，取2只25 mL 烧杯分别作为滴定管和对照管。对照管加入底物缓冲液8 mL，15 mmol/L EDTA 1.1 mL，样本0.4 mL。测定管加入底物缓冲液8 mL，0.5 mmol/L CaCl20.2 mL，样本0.4 mL。37 ℃水浴后， 对照管加入0.5 mmol/LCaCl2 0.2 mL，测定管再加入15 mmol/L EDTA 1.1 mL。混匀后用高灵敏度pH 计分别测量两管的pH 值，用微量吸枪吸取新标定的稀盐酸(0.004 mol/L)将对照管的pH 滴定至测定管的pH 值，以所消耗的盐酸测定观众酶的活力。1 个PLA2 活性单位规定为在37℃下，每分钟每毫升样本反应消耗1 nmol 盐酸[1 U=1 nmol/(mLmin)]。PLA2(U)=NV1062.5/t;N、V 分别为所消耗盐酸的体积(mL) 和浓度(mol/L)，t 为反应时间(min)。
2)采用免疫组化法检测移植髓核髓核IL-6 和TNF- 表达的影响： 术后28 d 分别取6 个移植髓核标本，10%甲醛溶液固定。将玻片放在玻片架上置于烘箱(温度60 ℃)中烘烤60 min。PBS 浸泡，然后加上100 L 的血清37 ℃孵育30 min。擦去过多的血清，加入一抗室温孵育过夜。滴加HRP 标记的二抗，37 ℃孵育30 min。PBS(0.01 mol/L)清洗5 min，共3 次。DAB显色(镜检出现黄色即可终止实验，用去离子水终止显色实验。将终止显色的玻片用自来水冲洗， 用苏木素复染45 s。用自来水冲洗复染过的玻片，然后用0.5%～1%的盐酸酒精分化2 s，除去非特异结合的苏木素(苏木素特异性结合细胞核)， 然后迅速放置流水里冲洗。用中性树胶封片， 然后置于凉片架上放在通风橱内凝固。用光学显微镜观察各组免疫组化染色切片， 将免疫组化染色切片置于相同强度光线下用高倍镜观察，随机选取视野(每张切片选取5 个视野)，通过数码摄像机摄取图像，保存。利用图像分析系统，设定测量参数后，计算各个标本每个视野中阳性细胞数，对图像进行全屏分割并进行自动测量、记录。阳性细胞反应结果为相应部位呈棕黄色或棕褐色染色。在高倍镜下，同等光照强度下，每张切片利用随机拍摄的5 个视野相片，先测出图片的有效测量面积，然后测该面积区域内阳性细胞个数。
1.7 统计学处理
应用SPSS19.0 统计软件处理。实验结果满足正态分布和方差齐性，以(xs)表示，t 检验采用配对t 检验和两组独立样本t 检验， 多组间差异显著性检验用单因素方差分析， 组间比较用SNK(q)检验， 各处理组与对照组比较用Dunnett t 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠髓核组织中PLA2 活性比较。造模成功经大鼠灌胃后第7 日， 各实验组PLA2 的活性达到最高峰，但中药组、西药组明显低于模型组(P 0.05 或P 0.01)。在第7 日， 中药组对髓核组织中PLA2 活性的影响不如西药组明显，差异无统计学意义(P 0.05)，说明在第7 日两组都可以对髓核组织中的PLA2 活性起到抑制作用， 但中药组不如西药组明显。在第14、28 日，中、西药两组较模型组都可以对髓核组织中的PLA2 活性起到抑制作用(P 0.05)，模型组髓核组织中的PLA2 活性值仍处在较高的水平。在各个时间段中、西药物两组在治疗效果无明显差异，说明枳壳甘草汤同样能起到抑制炎症因子， 降低髓核组织中PLA2 活性的作用。
2.2 各组大鼠腰椎间盘突出模型髓核中IL -6 和TNF- 表达比较见表2，图1，图2。在造模28 d 后，各组移植髓核组织内阳性细胞反应结果为相应部位呈棕黄色或棕褐色染色。其中模型组IL-6 和TNF- 表达高于西药组和中药组(P 0.05 或P 0.01)，中、西药组比较差异无统计学意义(P 0.05)，表明中、西药物在下调髓核中IL-6 和TNF- 表达上没有区别。
3 讨论
本课题所选用的枳壳甘草汤系全国名老中医、全国师承制导师之一的龚正丰教授在总结吴门医派葛氏伤科基础上加之其临证经验总结而成。龚正丰教授认为络脉是气血运行的通道， 络脉阻滞不通则引起各种疼痛，即不通则痛。龚老在自己多年骨伤科临诊的基础上，针对LDH气滞不畅、瘀血内停、津凝水聚的病理机制，依据络以通为用，宜疏不宜堵的原则，提出以理气化瘀利水通络法治疗LDH， 拟方枳壳甘草汤，方药组成为枳壳、甘草、当归、丹参、三棱、莪术、黑白丑，临床随症加减。
自从PLA2 被发现在突出髓核中存在后， 引起了临床的关注， 对其的研究也在不断的加深。彭宝淦等研究发现正常机体内的PLA2 受到两种因素的影响，一种是内源性抑制物， 另一种是促进物PLA2 激活蛋白。当这两种影响因素失衡后，机体启动PLA2 蛋白，这也是引起椎间盘组织发生退变的重要因素。因此通过下调PLA2 的活性，可恢复人体内的这种平衡，从而延缓椎间盘的退变。有学者为了证实PLA2 的致炎性。其他学者采用硬膜外移植髓核的方法观察大鼠的疼痛行发现PLA2 在诱发神经根疼痛机理上起一定作用; 另一方面说明采用PLA2 抑制剂能够减轻LDH患者的神经根疼痛LA2 其作为局部炎症组织的启动物质，在炎症形成过程重起着关键作用，因此抑制这种酶活性可减少PG、LT 和血小板激活因子(PAF)，减轻TNF 的细胞毒作用， 可起到减缓腰椎间盘的退变，对缓解腰腿痛等临床症状具有重要意义。
本实验研究结果显示， 在大鼠造模后7 d 各组的PLA2 活性值达到最高， 经枳壳甘草汤干预7 d 后PLA2 活性值明显下降，但不如西药组明显。但在14、28 d 后枳壳甘草汤组髓核组织中PLA2 活性值与西药组差异不明显，中、西药物在降低PLA2 活性值方面无差异，说明枳壳甘草汤具有降低突出髓核组织中PLA2活性值的作用， 起到和抗炎镇痛类西药同样的效果。其作用机制可能与枳壳甘草汤中药有效成分具有的抗炎、降低血液黏稠度、抑制血小板聚集和凝血功能、改善微循环等作用有关。从本实验的研究结果发现，枳壳甘草汤可抑制髓核组织中PLA2 的活性， 为临床治疗LDH 提供了新的思路。
Gronblad 等研究发现TNF- 可增加退变椎间盘组织细胞中PG 等炎性介质的含量， 诱发椎间盘继发性的病理变化。TNF- 是具有强致痛的炎症介质，可侵入神经根组织中，从而产生神经根疼痛。Liu 等运用TNF- 直接作用于离体的退变椎间盘细胞，检测后显示TNF- 可提高MMPs 的表达，两者之间在一定程度存在着时效关系。IL-6 则是具有多功能的炎症细胞因子。现在的研究表明，IL-6 具有促进炎症和抗炎的双重特性。IL-6 能够增加炎症介质的聚集、促进炎症介质的合成分泌， 并对MMPs 的表达起到一定的诱导作用。IL-6 还导致蛋白聚糖Ⅱ型胶原的比例失调，使得髓核中的水分加速流失，最终导致椎间盘退变的加速。王民等对正常的椎间盘组织及突出椎间盘组织进行体外培养，发现突出椎间盘组织中IL-6 含量高于正常椎间盘组织， 采用免疫组化法显示，IL-6 阳性细胞在突出椎间盘组织中表达最强，提示IL-6 可能参与了腰椎间盘退变的过程。
本实验研究发现， 枳壳甘草汤能明显抑制移植髓核内阳性细胞IL-6 和TNF- 的表达， 从而减轻炎症介质的合成，下调MMPs 的表达，起到延缓椎间盘退变的作用。这可能与枳壳甘草汤中的中药成分作用有关，比如枳壳成分川陈皮素具有抑制血栓、抑制基质金属蛋白酶表达及抗炎镇痛的作用; 当归提取物能够提高小鼠对热刺激致痛的痛阈值，起到有抗炎镇痛作用;甘草提取成分中甘草次酸具有明显的抗炎作用， 同时具有肾上腺皮质激素样作用，可起到解痉止痛的作用。
