摘要：为探明宿根甘蔗（Saccharum officinarum L.）发生黄化的原因，遏制黄化现象的蔓延，对宿根甘蔗苗期发生黄化较严重的产地进行实地调查，并采样分析各产地宿根正常苗种植地、宿根黄化苗种植地和新植蔗苗种植地的甘蔗根系、叶片与土壤的各项生理生化指标。结果表明，宿根黄化苗种植地的土壤酚酸含量高于宿根正常苗种植地和新植蔗苗种植地，宿根甘蔗黄化苗的根系细胞严重受损，根系细胞膜透性显著高于宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗，根系活力弱；叶片活性铁含量、硝酸还原酶活性和叶绿素含量则低于正常苗和新植苗。说明长期连作导致土壤酚酸类有毒物质大量积累，甘蔗根系中毒，根系受损细胞膜透性增大，大量内容物外渗，死亡的根细胞残体和根系分泌物又加速有毒物质的积累；而植株吸收过量的锰和铝后，降低了甘蔗叶片的硝酸还原酶活性，抑制了甘蔗正常的氮代谢；植株发育不良对新根的萌发和生长也不利，造成植株体内铁锰比例失衡，阻碍宿根甘蔗对铁的吸收与活化，最终宿根甘蔗幼苗因缺铁而出现黄化。
关键词：甘蔗（Saccharum officinarum L.）；土壤；有毒物质；黄化病
中图分类号：S435.661.3+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）14-3641-07
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.14.025
Abstract： In order to explore the reasons for etiolation of perennial sugarcane（Saccharum officinarum L.） seedings and curb it spreading， four regions where the etiolation phenomenon is serious were investigated； then soil， leaves and roots samples were collected from normal fields，etiolated fields and newly planting fields of sugarcane to analyze their physiological and biochemical indicators. Results showed that the soil phenolic acids content in etiolated fields was higher than in normal fields and new planting fields；the roots of etiolated perennial sugarcane seedlings were damaged seriously； and roots membrane permeability was higher than normal and new planting sugarcane seedlings； roots system vitality of etiolated seedlings was weak；and activate Fe content，nitrate reductase activity and chlorophyll content in leaves was lower than normal and new planting seedlings.Continuous cropping for a long time led to phenolic acids accumulation，which infected roots system， so that the membrane permeability of roots system increased， lots of contents exuded. The dead root cells and root secretion could accelerate accumulation of toxic substances. Once the plants absorbed excess Mn and Al，it could reduced the nitrate reductase activity and inhibit nitrogen metabolism of sugarcane.The germination and growth of new roots were depressed due to the plants' poor development. The proportion of Fe and Mn was imbalanced in the plants， which hindered the sugarcane form absorbing and activating Fe. At last， the perennial sugarcane young soot went to etiolate for short of Fe.
Key words： sugarcane（Saccharum officinarum L.）； soil； toxic substance； yellowing disease
随着农村劳动力流动加快，省工省力的宿根甘蔗（Saccharum officinarum L.）种植受到蔗农的追捧，现在每年宿根甘蔗留种面积占甘蔗种植总面积的60%～70%[1]。但近年来，部分蔗区不同程度地出现了宿根甘蔗幼苗黄化现象，发病率高达20%～30%，严重影响了宿根甘蔗的生长和产量[1]。科技工作者已对各种作物叶片黄化的原因和防治措施做了大量的研究，但是关于宿根甘蔗苗期黄化的成因和防治办法还未达成共识。探明宿根甘蔗苗期黄化的真正原因，对症下药，遏制黄化蔗地面积的进一步扩大，促进宿根甘蔗的后期生长，减轻苗期黄化带来的损失，将对稳定蔗区面积、保证蔗糖产量、提高农民收入和种蔗积极性产生重要的影响。 1 材料与方法
1.1 材料
在2014年4-6月（宿根甘蔗幼苗生长阶段），对蔗苗黄化发生较为严重的南宁市江南区吴圩镇和扶绥县渠黎镇、昌平乡、新宁镇4个产区各确定1个试验点，对试验点田间出现黄化的甘蔗植株做标记，分2次取样，分别采集宿根甘蔗正常苗、新植蔗苗以及宿根甘蔗黄化苗生长的根际土壤、甘蔗根系及甘蔗叶片；第一次取样吴圩镇和渠黎镇的取样日期在2014年4月18日，昌平乡和新宁镇的取样日期为5月1日。第二次取样吴圩镇和渠黎镇的取样日期在6月20日，距第一次取样相隔约2个月，此时黄化植株基本转绿；昌平乡和新宁镇取样日期为5月16日，距第一次取样相隔半个月，此时黄化苗植株仍未转绿。样品妥善保存后，带回广西大学农学院实验室进行有关试验指标的测定。
1.2 样品制备
以宿根甘蔗正常苗的根系作为主对照（R-CK1），新植蔗苗的根系为次对照（R-CK2），宿根甘蔗黄化苗的根系作为处理，各挖取10株宿根甘蔗正常苗、新植蔗苗和宿根甘蔗黄化苗的根系，用塑料袋封装好后带回实验室，洗净拭干，统计白根数，计算白根数在总根数中所占的比例，然后及时进行生理指标的测定。
与根系的取样方式一致，以宿根甘蔗正常苗的叶片作为主对照（L-CK1），新植蔗苗的叶片为次对照（L-CK2），宿根甘蔗幼苗黄化苗的叶片作为处理，都取15株甘蔗的+2或者+3叶，用塑料袋封装好，冰冻后带回实验室[2]。其中一部分用去离子水洗净、拭干、切碎，分别测定叶绿素含量、硝酸还原酶活性、根系细胞膜透性、活性铁、全锰、全铝等指标，另一部分放入105 ℃烘箱内杀青30 min后在70 ℃下烘干，粉碎，用塑料袋密封保存。
以宿根甘蔗正常苗种植地的土壤作为主对照（S-CK1），新植蔗苗种植地的土壤为次对照（S-CK2），宿根甘蔗黄化苗种植地的土壤作为处理，随机多点（10～15个点）采集甘蔗生长的根际土壤（距地表10～20 cm左右，约1 kg），多点土壤混合后，风干过18目筛和-20 ℃冰冻2种方式保存。
1.3 测定
样品叶绿素含量、活性铁含量、酶活性、根系活力、根系细胞膜透性等需要新鲜样品的指标带回实验室后及时进行测定，暂未能及时测定的样品在
-20 ℃的低温环境下保存；土壤酶活性在土壤风干后测定；叶片全锰、全铝、土壤酚酸等含量则在样品烘干粉碎后再进行测定。测定仪器主要有ZEEnit700P原子吸收光谱仪、电子天平、冷冻离心机、722型紫外可见分光光度计、DDS-IIA型电导仪等。
根系活力的测定用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[3]，根系细胞膜透性的测定用电导率法（细胞膜透性的变化主要通过细胞浸出液电导率的变化来反映）[4]，叶绿素含量的测定采用乙醇-丙酮浸提法[3]，叶片硝酸还原酶活性的测定采用离体法[5]，叶片活性铁含量和全锰含量的测定用原子吸收分光光度计法[1]，叶片全铝含量的测定用铬天青S显色法，土壤过氧化氢酶活性的测定用高锰酸钾滴定法，土壤脲酶活性的测定用改良靛酚蓝比色法[6-8]，土壤酚酸含量的测定用磷钼酸-磷钨酸比色法[9]。
1.4 数据处理
利用Microsoft Office Excel 2010、SPSS 17.0统计软件进行数据处理和作图，同时计算4个试验点3类甘蔗苗各有关指标的平均数、相关系数等参数，并进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 不同甘蔗苗根系发生情况
根系在植物生长过程中扮演着吸收营养与水分，固定植株的角色，因此健康的根系是作物高产的基础，尤其是当年新发出的白根数多寡是宿根甘蔗苗营养保障的关键所在；试验分2次取样统计出的4个试验点3类甘蔗苗的根系白根数在根系总数中占的比例情况见图1。从图1可见，新植蔗苗在4个点、2次调查中白根数占根系总数的比例都在25%以上，远高于宿根甘蔗正常苗。而宿根甘蔗黄化苗在第一次取样的测定结果显示，白根数在根系总数中占的比例不到5%，第二次取样的测定结果显示，转绿的吴圩点和渠黎点2地的宿根甘蔗黄化苗白根数在根系总数中所占的比例才恢复到正常苗的水平，但仍然是3类甘蔗苗中白根数在根系总数中所占比例最低的。
2.2 不同甘蔗苗的根系活力比较
根系活力是以测定植物根系对标准氧化还原色素TTC的还原速率来综合评判根系吸收、合成、氧化和还原等能力的生理指标，试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗的根系活力情况见图2。从图2分析可见，第一次取样的测定结果显示，4个点的宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗的根系活力均能达到100～200 μg/（g・h），而宿根甘蔗黄化苗根系活力在30 μg/（g・h）以下，后者极显著低于宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗（P
2.3 不同甘蔗苗的根系细胞膜透性比较
细胞膜透性（细胞浸出液电导率）可以作为评价细胞膜受伤害程度的指标[10，11]，试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗的根系细胞浸出液电导率情况见图3。从图3可以看出，第一次取样的测定结果显示，4个试验点的宿根甘蔗黄化苗根系细胞浸出液电导率均在50%以上，极显著高于同点宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗的电导率（P
0.05）；而取样间隔时间较短的昌平点和新宁点仍未恢复到正常水平。因此，试验认为宿根甘蔗发生黄化是自身的毒害作用导致根系细胞遭到破坏、细胞内容物大量外渗、进而根系衰亡、造成吸收能力减弱所致。 2.4 不同甘蔗苗的叶片叶绿素含量比较
叶绿体是植物进行光合作用的场所，叶绿素的含量直接影响植物对光能的利用效率，叶绿素的合成受阻，将引起植株叶片失绿黄化甚至白化[12]；试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗的叶片叶绿素含量情况见图4。从图4可以看出，第一次取样的测定结果显示，4个试验点的宿根甘蔗黄化苗叶绿素含量均极显著低于宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗（P
2.5 不同甘蔗苗的叶片硝酸还原酶活性比较
硝酸还原酶是一种氧化还原酶，其活性强弱反映了植物对氮素利用效率的高低。试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗的叶片硝酸还原酶活性强弱情况见图5。从图5分析可见，第一次取样的测定结果显示，4个试验点的甘蔗苗叶片硝酸还原酶活性均比较弱。其中吴圩点、新宁点的宿根甘蔗黄化苗叶片硝酸还原酶活性低于宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗，渠黎点的宿根甘蔗黄化苗叶片硝酸还原酶活性低于宿根甘蔗正常苗，差异都达到了极显著水平（P
0.05）。第二次取样的测定结果显示，各试验点的甘蔗叶片硝酸还原酶的活性较第一次有了明显提高，叶片转绿的吴圩点和渠黎点宿根甘蔗黄化苗的叶片硝酸还原酶活性甚至超过了新植蔗苗和宿根甘蔗正常苗，其中渠黎点的宿根甘蔗黄化苗的叶片硝酸还原酶活性远高于宿根甘蔗正常苗，差异达到了极显著水平（P
2.6 不同甘蔗苗的的叶片活性铁含量比较
铁是合成叶绿素必需的微量元素，同时也是细胞色素的组成成分[12]；试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗叶片的活性铁含量情况见图6。从图6可见，第一次取样的测定结果显示，4个试验点的宿根甘蔗黄化苗叶片的活性铁含量均在10 mg/kg左右。而除吴圩点外，其他点的宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗的叶片活性铁含量均在20 mg/kg以上，4个试验点的宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗的叶片活性铁含量都与宿根甘蔗黄化苗的叶片活性铁含量存在极显著差异（P
2.7 不同甘蔗苗的叶片全锰含量比较
锰是维持叶绿体结构部分的微量元素，同时也是许多酶的组成成分，对氮素的代谢影响显著，并且在根中积累；但是过量的锰会抑制根细胞对铁的吸收，造成叶片变薄，生物量下降[12]；试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗叶片的全锰含量情况见图7。从图7可知，除渠黎点第一次取样的测定结果外，其他3个点2次取样以及渠黎点第二次取样的测定结果均是宿根甘蔗黄化苗叶片全锰含量极显著高于同试验点的宿根甘蔗正常苗和新植蔗苗（P
2.8 不同甘蔗苗的叶片全铝含量比较
王月平等[13]在对植物抗铝毒的机制中提到，植物铝胁迫能引起叶绿素含量下降，叶片黄化坏死；试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗叶片的全铝含量情况见图8。从图8可知，宿根甘蔗黄化苗的叶片全铝含量并未呈现出特别明显的规律；并且第二次取样测定的数据显示，各点3类甘蔗苗叶片的全铝含量均下降，其中吴圩点和新宁点的宿根甘蔗黄化苗全铝含量降幅最大。
2.9 不同甘蔗苗种植地土壤的过氧化氢酶活性比较
土壤过氧化氢酶能将对植物生长有害的物质过氧化氢分解成氧气和水，从而达到解毒的效果，土壤过氧化氢酶活性的大小也从侧面反映出土壤受有害物质毒害的程度；试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗种植地土壤的过氧化氢酶活性情况见图9。从图9可知，在第一次取样中，各试验点宿根甘蔗正常苗种植地土壤过氧化氢酶活性较宿根甘蔗黄化苗种植地的大，差异达到了极显著水平（P
2.10 不同甘蔗苗种植地土壤的脲酶活性比较
脲酶是能够将尿素分解为植物能吸收的铵态氮的专一性酶类，所以土壤脲酶的活性反映了土壤肥力的状况[14]；试验以单位质量的土壤在1 d之内将尿素转化为铵态氮的质量来评价4个试验点、3类甘蔗苗种植地的脲酶活性，结果见图10。从图10看出，第一次取样测定的数据显示，除新宁点外，其他3个点的宿根甘蔗黄化苗种植地土壤脲酶活性均显著低于宿根甘蔗正常苗种植地（P
土壤酚酸类物质被众多学者认为是造成土壤肥力衰退的主要原因之一[15，16]，试验分2次取样测定出的4个试验点、3类甘蔗苗种植地的土壤酚酸含量情况见图11。从图11可以看出，在2次取样的测定结果中，宿根甘蔗正常苗种植地的土壤酚酸含量大多数都要显著（P
2.12 相关性分析
将试验测定的各类甘蔗苗叶片和根系以及蔗苗种植地土壤的各项生理生化指标进行相关性分析，结果见表1。从表1可见，甘蔗叶片叶绿素含量与根系活力以及叶片活性铁含量呈极显著正相关，与根系细胞膜透性和叶片全锰含量呈极显著负相关。叶片活性铁含量与根系活力和叶片硝酸还原酶活性呈极显著正相关，与根系细胞膜透性、叶片全锰含量呈极显著负相关，与叶片全铝含量呈显著负相关。说明植株正常状态下的根系活力和氮代谢促进，作物对活性铁的吸收，锰和铝等元素的过量积累则毒害作物根系，钝化硝酸还原酶的活性，抑制作物对其他营养元素的吸收利用。
从表1还可见，土壤酚酸含量和叶片全锰含量都与根系活力呈极显著负相关，一方面说明酚酸对作物根系具有毒害作用，反过来根系细胞膜透性增大，内容物外渗，又会加速土壤酚酸的积累；另一方面也说明作物根系细胞膜透性增大会使植株体内积累过量的锰，同时锰过量又进一步引起根系受损。
3 讨论
试验通过对宿根甘蔗正常苗种植地、宿根甘蔗黄化苗种植地和新植蔗苗种植地进行取样调查和各项指标的测定与数据分析，并综合前人在该领域的研究，得出宿根甘蔗苗期黄化的原因是长期连作导致有毒物质，特别是酚酸类物质的大量积累造成的，甘蔗根系中毒后，根系受损，细胞膜透性增大，大量内容物外渗，死亡的根细胞残体和根系分泌物又反过来加速有毒物的积累，同时吸收过量的锰和铝，这一方面降低了甘蔗叶片的硝酸还原酶活性，抑制了正常的氮代谢，植株发育不良，并对新根的生长不利，如此造成恶性循环；另一方面导致植株体内铁锰比例失衡，阻碍宿根甘蔗对铁的吸收和活化，最终宿根甘蔗因缺铁而出现黄化。
有学者推测酚酸的作用位点极有可能在膜上[17]；还有研究认为植物的根系分泌物通过破坏细胞壁而使膜透性增加，细胞内容物大量外渗，导致植物根系慢慢死亡[18]。在本试验中，宿根甘蔗苗特别是宿根甘蔗黄化苗的根系多为丧失生命活力的黑根、病根，其细胞膜透性增大，对蔗苗的伤害显著高于宿根正常苗和新植蔗苗，这与前人的研究结果一致。翟丙年等[19]认为，植物吸收的铁离子形态是Fe2+，Fe3+在进入细胞之前必须在根表被还原成Fe2+才行；植物在缺铁的情况下，根尖能向外界分泌大量的有机酸等物质，同时根尖细胞膜上的还原酶活性增强。而本试验中，宿根甘蔗的根系细胞已经受到极大的破坏，失去了还原Fe3+的能力，使宿根蔗因缺乏活性铁而黄化。
Chou[20]的研究表明，抑制宿根甘蔗生长的主要原因是化感自毒物质的积累。酚酸是重要的化感物质[21]。酚酸类物质进入土壤后能够降低叶片叶绿素的含量，从而使光合产物减少，这对于幼苗的生长抑制尤为明显[22]。酚酸类物质的化感作用与作物连作障碍有着密不可分的关系，降低作物根际土壤中酚酸类物质的含量，就能够极大程度地缓解植物自身自毒作用对产量和品质的影响。
参考文献：
[1] 陈桂芬，唐其展，黄玉溢，等.宿根甘蔗幼苗黄化的原因初探[J].南方农业学报，2012，43（1）：50-52.
[2] 陈桂芬，黄玉溢，唐其展，等.宿根甘蔗幼苗黄化发生的原因与矫正措施[J].中国糖料，2014（1）：5-7，12.
[3] 张宪政.作物生理研究法[M].北京：农业出版社，1992.145-150.
[4] 王学奎.植物生理生化试验原理与技术[M].北京：高等教育出版社，2006.
[5] 周 树，郑相穆.硝酸还原酶体内分析方法探讨[J].植物生理学通讯，1995（1）：47-49.
[6] 杨梅焕.毛乌素沙地东南缘沙漠化演变机制与植物的耐胁迫性研究[D].西安：西北大学，2010.
[7] 黄 娟，李 稹，张 健.改良靛酚蓝比色法测土壤脲酶活性[J].土木建筑与环境工程，2012，34（1）：102-107.
[8] 马宁宁.设施番茄根围土壤的微生物特性研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2013.
[9] 吴 萼，徐 宁，温美娟.磷钼酸-磷钨酸盐比色法测定土壤中总酚酸含量[J].环境化学，2000，19（1）：68-72.
[10] 孙文越，王 辉，黄久常.外源甜菜碱对干旱胁迫下小麦幼苗膜脂过氧化作用的影响[J].西北植物学报，2001，21（3）：487-492.
[11] CAKMAK I，HENGELER C，MARSCHNER H.Partition of shoot and root dry matter and carbohydrates in bean plants suffering from phosphrus，potassium and magnesium deficiency[J].Journal of Experimental Botany，1994，45：1245-1250.
[12] 王平荣，张帆涛，高家旭，等.高等植物叶绿素生物合成的研究进展[J].西北植物学报，2009，29（3）：629-636.
[13] 王月平，章 艺，吴玉环，等.植物铝毒害及抗铝毒机制[J].湖北农业科学，2011，50（19）：3900-3903.
[14] 杨 涛，李玉英.高寒草甸土壤脲酶活性的研究[J].生态学报，1988，8（3）：220-225.
[15] 吕卫光，沈其荣，余廷园，等.酚酸化合物对土壤酶活性和土壤养分的影响[J].植物营养与肥料学报，2006，12（6）：845-849.
[16] 吴凤芝，赵凤艳，马凤鸣.酚酸物质及其化感作用[J].东北农业大学学报，2001，32（4）：402-407.
[17] EINHELLIG F A. Mechanism of action of all chemical in allelopathy[J]. Allelopathy，1995（1）：97-115.
[18] 王 闯，徐公义，葛长城，等.酚酸类物质和植物连作障碍的研究进展[J].北方园艺，2009（3）：134-137.
[19] 翟丙年，刘海轮，尚浩博，等.植物吸收利用铁的机理[J].西北植物学报，2002，22（1）：184-189.
[20] CHOU C H. Role of allelopathy in sustainable agriculture： Use of allelochemicals as naturally occurring bio-agrochemicals[J].Allelopathy Journal，2010，25（1）：3-16.
[21] 李华玮，赵绪永，李鹏坤.作物连作障碍中酚酸物质的生物降解研究[J].中国农学通报，2011，27（18）：168-173.
[22] 张淑香，高子勤.连作障碍与根际微生态研究II.根系分泌物与酚酸物质[J].应用生态学报，2011，11（1）：152-156.