摘要：以珍贵树种土沉香（Aquilaria sinensis）幼茎为材料，研究土沉香启动培养中外植体消毒的最适方法和芽诱导、愈伤组织诱导的最适培养基，植株不同部位的幼茎褐变率比较以及幼茎褐变程度与相关生理指标的关系。结果表明，土沉香启动培养中外植体幼茎的消毒方法以75%的乙醇浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡5 min为最佳；芽诱导的培养基以1/2 MS+0.01 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA为最佳，诱导率为60%；愈伤组织诱导的培养基以MS+0.05 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA为最佳，诱导率为80%；上部幼茎和下部幼茎相比较，上部幼茎的褐化程度较低。幼茎褐变程度与相关生理指标的关系为：总酚含量越低，PPO活性越低，POD活性越高，褐变越严重。总酚含量下降是导致幼茎褐变的最主要原因。
关键词：土沉香（Aquilaria sinensis）；启动培养；消毒；芽诱导；愈伤组织诱导；褐变率；生理指标
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1742-04土沉香（Aquilaria sinensis）又称白木香、香材等，为瑞香科常绿乔木，其树干可分泌一种珍贵中药――沉香。沉香是中国、日本、印度、东南亚以及中东国家传统名贵药材和天然香料。土沉香是我国生产沉香的惟一植物资源。长期以来，其生态环境一直遭到破坏，再加上人们掠夺式的采掘，土沉香野生资源量在不断减少。《2000年世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》把土沉香列为易危植物，并指出土沉香只在云南景洪、广东、海南、广西等地可见，中国所特有[1]。为了更好地保护和开发利用土沉香，广东、云南等地对土沉香组织培养体系进行了一些研究。如叶勤法等[2]取白木香嫩枝的叶片和茎段诱导愈伤组织，产生不定芽，再进行生根诱导，形成完整植株，取得了较好的结果，增值系数较高，生根率达100%；兰芹英等[3]对白木香成熟胚的组织培养及植株再生进行研究，筛选出了利于丛生芽和幼苗生根的培养基，其中丛生芽诱导率不高，生根率达到85%；徐强兴等[4]对土沉香快繁技术进行研究，利用间接生根法生根效果较好，生根率达86%，丛生芽增殖率高，且玻璃芽率低；杜勤等[5]用不同外植体、光照条件、激素对白木香愈伤组织进行了诱导，结果表明利用叶片黑暗培养有利于愈伤组织的形成；何旭君等[6]利用土沉香幼芽茎段进行组培快繁，筛选出了比较适合芽诱导的培养基及移栽基质，移栽成活率高达82%。但土沉香的种源不同，其组织培养中的最适培养基是否有差别，本试验以广西种源的土沉香幼茎为材料，在进行启动培养研究的基础上，分析了植株不同部位的幼茎褐变率及其生理指标的关系，为在广西进行土沉香组培并提高组培成活率提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为广西大学林学院苗圃实验基地1年生土沉香实生苗，试验于2012年12月～2014年5月间进行，地点设在广西大学林学院组培实验室和植物生理实验室。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒 于干旱的晴天，从苗圃基地土沉香种子苗优选株上剪取健壮的幼嫩茎段，剪去叶片，将茎段浸泡在洗衣粉或洗洁精溶液中，用毛刷将外植体表面刷净，再用自来水冲洗约30 min。然后将土沉香茎段用75%乙醇浸泡30 s，再利用0.1%升汞设置时间梯度对外植体幼茎进行消毒处理，获得能够对外植体幼茎彻底消毒但又不会致死的消毒方法。接种2周后观察统计污染数和污染率。
1.2.2 启动培养芽诱导 设置植物生长素NAA、2，4-D，细胞分裂素6-BA、KT等的浓度梯度培养基，研究不同植物激素浓度配比对土沉香茎段芽诱导率的影响。共32个培养基，其中19个以MS为基本培养基，13个以1/2 MS为基本培养基，每个配方培养基均30瓶，每瓶接种1个外植体幼茎。培养条件为温度25～27 ℃， 每天光照12 h， 光照度为2 000 lx，在接种后20 d进行观察和数据统计。
1.2.3 启动培养愈伤组织诱导 设置植物生长素2，4-D、细胞分裂素6-BA的浓度梯度培养基，研究不同植物激素浓度配比对茎段愈伤组织诱导率的影响。共7个以MS为基本培养基的配方，每个配方培养基均30瓶，每瓶接种1个外植体幼茎。培养条件同芽诱导，在接种后15 d进行观察和数据统计。
1.2.4 启动培养生理指标的测定 于2014年4月16日采集土沉香植株不同部位（苗木0～35 cm及35～70 cm）的外植体幼茎，并将其培养于MS培养基中，观察记录褐变情况，每隔5 d进行一次生理指标的测定。总酚含量采用福林酚显色法测定[7]；多酚氧化酶（PPO）活性采用邻苯二酚法测定[8]；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（Nitro blue tetrazolium chloride，NBT）比色法测定[9]；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定[10]；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性采用紫外吸收法测定[11]。
2 结果与分析
2.1 启动培养外植体消毒
在对外植体表面消毒时， 一般消毒处理时间越长，污染率会降低， 但外植体的存活率也会降低。土沉香外植体接种后10 d内发现真菌污染和细菌污染，0.1%升汞不同消毒时间对土沉香茎段污染率的影响见表1。由表1可知，经0.1%升汞消毒5 min的效果最好，土沉香幼茎污染率较小，为10.0%，并且幼茎长时间保持绿色，正常生长。
2.2 启动培养芽诱导
土沉香外植体接种后20 d左右长出不定芽，不同激素对土沉香芽诱导的影响见表2。由表2可知，相对于以MS为基本培养基的配方，以1/2MS为基本培养基的配方土沉香芽诱导率均较高，其中以22号处理1/2 MS+0.01 mg/L NAA +0.2 mg/L 6-BA的诱导率最高，达到60.0%，这与何旭君等[6]的沉香树组织培养快速繁殖技术研究结果一致。