摘要：以秀珍菇（Pleurotus geesteranus）废菌糠为试验材料，采用浸提法提取漆酶，在单因素试验的基础上，结合正交试验利用喷雾干燥技术将获得的粗酶液制成酶制剂，研究漆酶提取及其酶制剂制备的最佳工艺条件。结果表明，最佳提取条件为磨料30 s，料液比1∶10（g∶mL），提取时间30 min，转速160 r/min，温度25 ℃。优化后喷雾干燥条件为进风温度95 ℃，热风流量3.5 m3/min，进料速度20 mL/min。该工艺可为大规模利用秀珍菇废菌糠生产制备漆酶酶制剂提供参考。
关键词：秀珍菇（Pleurotus geesteranus）；废菌糠；漆酶；喷雾干燥；酶制剂
中图分类号：S646 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）03-0081-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.019
Abstract： The fungi chaff of Pleurotus geesteranus were used to explore the spray drying conditions of laccase extract. And laccase preparation were optimized by orthogonal tests on the basis of single factor experiments. The results indicated that the optimal extraction conditions were crush time of 30 s，solid-liquid ratio of 1∶10（g∶mL），extraction time of 30 min，shaking speed of 160 r/min and extraction temperature of 25 ℃. The optimal spray drying conditions were as follows：inlet air temperature 95 ℃，flux rate 20 mL/min，hot air flow 3.5 m3/min. This study would provide a reference basis for the production of large scale production of laccase from Pleurotus geesteranus chaff.
Key words： Pleurotus geesteranus；fungi chaff；laccase；spray drying；enzyme preparation
秀珍菇（Pleurotus geesteranus）又名环柄香菇，朵形娇小、味道鲜美、营养丰富，深受广大消费者喜爱，是中国重要的经济农作物之一[1]。随着秀珍菇产业的蓬勃发展，每年产生大量的废菌糠，且呈逐年增加的趋势，目前大多废菌糠被随意丢弃、焚烧，不仅浪费资源，而且污染环境、破坏生态平衡。如何处理废菌糠已经成为亟待解决的问题[2-4]。据研究报道，秀珍菇收获后的废菌糠中仍含有漆酶（Laccase）、木聚糖酶、蛋白酶等丰富的生物酶[5，6]。其中漆酶属于蓝色多铜氧化酶家族[7]，是木质素降解酶之一，用途广泛。刘晓贞等[8]利用壳聚糖固定漆酶发现对2，4-二氯苯酚降解效果良好；林先贵[9]的研究表明，真菌漆酶可以转化多种有机污染物、修复土壤；Smith等[10]利用DEAE-纤维素固定漆酶制成传感器用以检测茶酚；Fei等[11]从1株白腐菌中分离出1个新的漆酶并应用于染料降解。目前，漆酶的产量不理想，生产成本高，离工厂化生产漆酶仍有较大的距离，限制了漆酶的应用。国内对漆酶产生菌研究多集中在白腐真菌，秀珍菇作为白腐真菌中漆酶产量较高的一类[12]，从秀珍菇废菌糠中高效提取制备漆酶酶制剂，不仅能够拓宽漆酶来源，同时能够增加废菌糠的附加值，促进秀珍菇产业的良性循环。
由于液态漆酶稳定性较差，难以长期保存，为提高其稳定性，使其便于贮藏和运输，通常需要将其制备成干燥的固体酶制剂[13、14]。本试验以秀珍菇废菌糠（主要成分为30%棉籽壳、30%细木屑）为原料，采用浸提法对漆酶的提取工艺进行了初步探索，并利用提取后的粗酶液，对喷雾干燥法制备漆酶酶制剂的工艺进行研究，以期得到符合工厂化应用要求的漆酶酶制剂，为废菌糠的开发应用拓宽方向。
1 材料与方法
1.1 漆酶粗酶液的提取
在其他提取条件一致的情况下，分别选取不同浸提液（水、醋酸钠缓冲液、丙二酸缓冲液、酒石酸缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液），磨料时间（未磨碎、30、60、90、120 s），不同料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，g∶mL，下同），不同提取温度（15、20、25、30、35 ℃），不同提取时间（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h），不同的摇床转速（100、120、140、160、180、200 r/min）进行漆酶粗酶液提取，并测定酶活力。
1.2 酶制剂的制备
1.2.1 单因素试验 在其他条件一致的情况下，分别选择不同进风温度（95、105、115、125、135、145、155、165、175、185 ℃），M料速度（10、15、20、25、30、35 mL/min），热风流量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m3/min）对粗酶液进行喷雾干燥制成酶制剂，并测定酶活力。
1.2.2 正交试验 在分析各因素对喷雾干燥效果影响的基础上，进一步对较优的喷雾干燥参数以酶活为指标，采用正交试验方法进行优化。
1.3 漆酶酶活力的测定 准确移取HAc-NaAc缓冲液（pH=4.5）2.7 mL、1 mmol/L ABTS溶液0.2 mL，混合摇匀，在30 ℃恒温水浴锅中水浴预热5 min。准确加入待测酶液 100 μL，于30 ℃恒温水浴锅水浴30 min，用分光光度计测定其在420 nm处的吸光度，420 nm处ABTS摩尔吸光系数为36 000 L/mol・cm。
2 结果与分析
2.1 漆酶提取的优化结果
为提高酶的提取效率，减少各种因素引起的酶活损失，应选择最适宜的条件进行提取。对漆酶的提取条件进行优化，结果见图1。由图1A可知，不同浸提液对提取的漆酶酶活影响较小，以柠檬酸-磷酸缓冲液作为浸提液时，效果略优于其他提取液，酶活达0.44 U/g，其次是水，以水为浸提液的漆酶酶活也达到0.32 U/g。由图1B可知，磨料时间对漆酶酶活也有一定的影响，漆酶酶活随着磨料时间的延长而升高，在30 s时，酶活达0.38 U/g。由图1C可知，随着液料比的增大，漆酶酶活逐渐升高，当料液比为1∶10时酶活达到0.301 U/g，当料液比高于1∶10时，提取液中漆酶酶活变化不大，且有下降的趋势。由图1D可知，随着温度的增加，漆酶酶活呈先升高后降低的趋势。当温度为25 ℃时，漆酶酶活达到峰值为0.17 U/g。从图1E可以看出，在提取时间为0～30 min时漆酶酶活迅速升高，由0.17 U/g上升到0.26 U/g，酶活在30～90 min变化不明显，90 min时达到峰值为0.28 U/g；在90～150 min时，漆酶酶活逐渐下降。由图1F可得，随着摇床转速的提高，漆酶酶活也逐渐增大，在摇床转速为100～160 r/min条件下，漆酶酶活上升趋势明显，在160 r/min时酶活达0.25 U/g，在160～200 r/min时上升趋势不明显，到后期甚至有下降的现象。
2.2 喷雾干燥单因素条件优化结果
固体酶制剂干燥工艺中，喷雾干燥因受热时间短、酶活损失小、操作简便等优点而被广泛应用。制备工艺佳、品质优的酶制剂需要调控好进风温度、进料速度、热风流量3个重要的工艺参数。本研究利用喷雾干燥技术制备漆酶酶制剂，对3个参数的优化结果如图2所示。
从图2A可得，随着温度的升高，漆酶酶活逐渐降低，且降低的速率较快，进风温度低于95 ℃时不易形成干粉，当进风温度为105 ℃时漆酶酶制剂的酶活最大，达到了4.20 U/g，故选用105 ℃为较佳的进风温度。从图2B可知，在进料速度10～15.0 mL/min，干粉的酶活呈快速增长，且在15.0 mL/min时达到了最大值4.95 U/g，随后酶活基本保持不变。总酶活在进料速度15.0 mL/min时达到最大值为1.43 U，之后总酶活呈快速下降的趋势，表明进料速度对干粉的得率具有重要的作用。综合考虑，酶制剂的酶活及总酶活在进料速度为15.0 mL/min时都能达到最大，故选用15.0 mL/min为较佳的进料速度。从图2C可知，随热风流量的增大，漆酶酶制剂的酶活变化不明显，而其总酶活随着热风流量的增加呈先上升后下降的趋势，且在3.0 m3/min时达到最大值2.57 U，因而，选用热风流量为3.0 m3/min。
2.3 喷雾干燥正交试验结果
为进一步优化漆酶酶制剂的喷雾干燥工艺条件，选取了进风温度、进料速度、热风流量为考察因素，其中各操作因素的水平数选定以单因素试验结果和已有的研究为基础，确定因素的水平范围为进风温度95～115 ℃、进料速度10～20 mL/min、热风流量2.5～3.5 m3/min进行L9 33正交试验设计（表1）。
由表1可知，热风流量对酶制剂酶活的影响最大，其次为进料速度，进风温度的影响相对较小。综合分析，确定试验3（即进风温度95 ℃，进料速度20 mL/min，热风流量3.5 m3/min）为漆酶粗酶液的喷雾干燥最佳工艺，在该条件下，制成的漆酶干粉酶制剂的总酶活可达2.65 U。
3 结论与讨论
漆酶是一类具有高效催化功能的铜蓝氧化酶，酶活力容易受到时间、温度、溶剂等的影响[15]，在喷雾干燥制备成干粉酶制剂时，必须调整适宜的温度、进料速度和热风流量才能减少处理过程中对酶制剂的酶活力造成的损失[16]。
本研究通过单因素试验对漆酶的提取工艺进行了优化，确定了从秀珍菇废菌糠中提取漆酶的最佳条件为磨料时间30 s，料液比1∶10，提取时间30 min，摇床转速160 r/min，提取温度25 ℃，在该条件下提取的漆酶酶活达0.38 U/g。同时利用喷雾干燥技术将粗酶液制备成干粉酶制剂，并对喷雾干燥制备漆酶酶制剂的条件进行优化。以进风温度、热风流量、进料速度对喷雾干燥条件进行单因素试验，初步确定了各因素的最适范围。在单因素试验的基础上，采用正交试验设计进一步优化，3个因素对制成的酶制剂的影响大小依次是热风流量>进料速度>进风温度。在最佳工艺条件下（进风温度95 ℃，进料速度20 mL/min，热风流量3.5 m3/min），制得总酶活达2.65 U的漆酶干粉制剂。
国内外市场漆酶缺口大、生产成本高[17-19]，因此利用食用菌废菌糠提取制备漆酶酶制剂具有来源丰富、价格低廉等优势，不仅能够制备大量的漆酶，同时将菌糠变废为宝，增加食用菌行业的收入。
参考文献：
[1] 黄良水，蔡为明，金群力.我国秀珍菇的发展现状与前景展望[J].食药用菌，2015（6）：340-343.
[2] 陈世通，李梦杰，李荣春.食用菌菌糠综合利用的研究现状[J].北方园艺，2011（19）：152-154.
[3] 张丽影，邢承华，潘 婷，等.食用菌菌糠_发与利用的研究进展（综述）[J].食药用菌，2015（2）：72-75.
[4] PHAN C W，SABARATNAM V. Potential uses of spent mushroom substrate and its associated lignocellulosic enzymes[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2012，96（4）：863-873. [5] 朱华玲，班立桐，徐晓萍.食用菌菌糠中的生物活性酶及其再利用[J].园艺与种苗，2011（1）：80-82.
[6] 袁志辉，刘小文，李常健，等.菌糠酶及其对环境污染物修复功能的研究进展[J].食用菌学报，2016，23（2）：110-118.
[7] REKADWAD B，KHOBRAGADE C. Fungi imperfecti laccase： Biotechnological potential and perspectives[J].Microbial Applications，2017，2：203-212.
[8] 刘晓贞，李 云，梁云霄，等.二氧化硅/壳聚糖大孔复合材料固定化漆酶及其对2，4-二氯苯酚的降解[J].高校化学工程学报，2016，30（1）：201-209.
[9] 林先贵.多环芳烃的真菌漆酶转化及污染土壤修复技术[J].微生物学通报，2017，44（7）：1720-1727.
[10] SMITH M W，GHINDILIS A L，SEOUDI I A，et al. A new restriction endonuclease-based method for highly-specific detection of DNA targets from methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Plos One，2014，9（5）：e97826.
[11] FEI Z，QI A，GE M，et al. A novel laccase from white rot fungus Trametes orientalis：Purification，characterization，and application[J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，102：758-770.
[12] O淑静，郭艳艳，吴晓华，等.不同食用菌品种产漆酶规律的研究[J].中国食用菌，2014，33（3）：38-40.
[13] 李秋园.纤维原料酶水解及酒精发酵的研究[D].杭州：浙江大学，2002.
[14] 肖安风，王 芳，倪 辉，等.单宁酶固体酶制剂制备及贮藏性能研究[J].食品科技，2013，38（2）：237-241.
[15] 杨 娟.白灵侧耳漆酶活性、纯化及其性质研究[D].北京：中国农业科学院，2014.
[16] 肖安风，丁 涛，倪 辉，等.喷雾干燥法制备柚苷酶固体酶制剂的工艺优化[J].中国食品学报，2013，13（3）：92-100.
[17] 刘 辉，韩振亚，苏焕斌，等.漆酶及其产生菌应用研究进展[J].广东化工，2016，43（7）：100-101.
[18] 潘志恒，岳 d，孙勇民，等.漆酶在食品工业中的应用与研究进展[J].农产品加工，2016（7）：49-51.
[19] 刘家扬，焦国宝，有小娟，等.真菌漆酶的性质、生产及应用研究进展[J].生物技术通报，2016，32（4）：24-33.