摘要：研究采用HPLC法对5个不同品种的柴胡（Bupleurum chinense DC.）根样品进行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析。结果表明，不同品种中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差异较大，这可能与柴胡的生长环境、采收年限等因素的影响有关。与传统方法相比较，HPLC法不仅操作简便、快捷，而且分析方法准确，重现性好。
关键词：柴胡（Bupleurum chinense DC.）；HPLC；柴胡皂苷a；柴胡皂苷d
中图分类号：R927.2；O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2519-02
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.030
The HPLC Method for Determination of Saikosaponin a and d Content in Bupleurum from Different Habitats
MA Ze-gang， HUANG Chun-hua， ZHONG Hui-yun
（Department of Pharmacy， Sichuan Vocational College of Health and Rehabilitation， Zigong 643000， Sichuan，China）
Abstract： The HPLC method for quantitative determination of saikosaponin a and saikosaponin d content in 5 Bupleurum samples from different habitats was applied. The results showed that， the saikosaponin a and d content of different varieties varied greatly， the reason of it may be related to the growing environment， harvesting years and other factors. Compared with traditional methods， the HPLC was a simple， quick， accurate method with good reproducibility.
Key words： Bupleurum chinense DC.； high-pressure liquid chromatography； saikosaponin a； saikosaponin d
柴胡（Bupleurum chinense DC.）为植物界伞形科柴胡属植物，以其根入药，是中国传统中药中非常重要和常用的药材，其性味苦凉，微寒，归肝、胆实经，具有和解表里，疏肝升阳，疏散退热等功效[1]。主要治疗感冒、发热、寒热往来、试验性肝损伤、调节内分泌和免疫系统等症状，在临床上已经用来治疗慢性毒性肝炎[2]。柴胡主要含有皂苷、挥发油、植物甾醇、黄酮类、多糖等成分[3-5]。其中柴胡皂苷为柴胡主要有效成分之一，现代药理研究表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d活性较强[6，7]。中国柴胡资源分布广泛，产地的自然环境差异大，为考察不同品种柴胡的质量情况，本研究采用HPLC法对中国5个不同产地的柴胡根样品进行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析，为柴胡生药质量评价提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 标准品购于成都瑞芬思生物科技公司，经HPLC面积归一化法测定， 纯度>98%；柴胡5个不同样品（湖北柴胡根、剑阁柴胡根、甘肃柴胡根、青川柴胡根、马公乡柴胡根）购于成都药材市场，经四川卫生康复职业学院副主任药师钟辉云鉴定为伞形科植物柴胡。除乙腈为色谱纯外，其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。高效液相色谱仪（美国Agilent公司）。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX EXTEND-C18（250 mm×4.6 mm，5.6 μm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱，其时间程序为0-24-27-30 min，乙腈体积分数相应为25.0%-69.0%-25.0%-25.0%；柱温30 ℃；检测波长210 nm；流速0.8 mL/min。
1.2.2 标准液制备 分别称取柴胡皂苷a标准品6.3 mg，柴胡皂苷d标准品7.7 mg，用甲醇溶解，再定容至10 mL。
1.2.3 悠啡芤旱呐渲 称取各样品粗粉1 g，一共3份，加0.1 g氢氧化钙，80%甲醇溶液50 mL，60 ℃提取0.5 h，过滤，滤液定容至50 mL。
1.2.4 标准曲线的绘制 将柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的标准液做5、10、20、40、80倍稀释，以峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x）作标准曲线，进行线性回归。各物质的回归方程、相关系数和线性范围见表1。
2 结果与分析
2.1 柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量测定
取样品供试液进行HPLC测试结果见表2。由表2可知，不同品种中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差异较大，其中柴胡皂苷a的含量以湖北柴胡根最高，剑阁柴胡根最低，柴胡皂苷d的含量以青川柴胡根最高，剑阁柴胡根最低。
2.2 重复性试验
取湖北柴胡根6份，按“1.2.3”制备供试液，按“1.2.1”进样进行测定，计算柴胡皂苷a的RSD为2.67%（n=6），柴胡皂苷d的RSD为2.31%（n=6）。
2.3 加样回收率的测定 取1 g湖北柴胡药材粉末，分别加入32.5、49.4 mg柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，按“1.2.1”进行测定，测其峰面积，柴胡皂苷a的回收率为102.35%，RSD为1.04%（n=6）；柴胡皂苷d的回收率为99.21%，RSD为1.31%（n=6）。
2.4 精密度试验
精密吸取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d混合标准品溶液按“1.2.1”进行测定，连续进样6次，记录其峰面积，计算柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的相对标准偏差。试验测得胡皂苷a、柴胡皂苷d的RSD分别为1.8%、1.6%，表明色谱系统精密度符合要求。
2.5 稳定性试验
取湖北柴胡供试液室温下放置，按上述色谱条件每隔2 h测定1次，8 h内共测5次，记录柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的峰面积，计算相对标准偏差。结果测得柴胡皂苷a的RSD为2.6%，柴胡皂苷d的RSD为2.1%，表明样品在8 h内稳定。
3 讨论
预试验结果表明，随着甲醇体积分数的增加提取率增加，当甲醇体积分数达到80%的时候，提取率达到最大，加氢氧化钙有利于提取纯化柴胡皂苷a、柴胡皂苷d。与传统方法相比较，本试验的提取方法不仅操作简便、快捷，分析方法准确，重现性好，而且采用了氢氧化钙提取柴胡皂苷，提取率高，在方法上有一定的创新。本试验结果表明，不同品种中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量差异较大，这可能与柴胡的生长环境、采收年限等因素的影响有关。本试验样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量均达到2010版《中国药典》规定“柴胡中柴胡皂昔a和d的总量不得少于0.30%”。因此，所测样品均具有一定的药用价值。本研究采用HPLC法对5个不同品种的柴胡根样品进行了柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量分析，可为柴胡的质量评价、提取分离纯化、临床应用开发提供一定的科学依据。
参考文献：
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