摘要：选定多个阶段小鼠卵巢进行切片染色和生殖细胞计数统计等分析，以发现该阶段小鼠卵巢的发育特点结果显示在胚胎发育第12.5d的生殖嵴中，大部分的生殖细胞正进行有丝分裂增殖，并以生殖包囊的形式存在；在出生后第2d的小鼠卵巢中，有大量紧密接触的原始卵泡，表明生殖包囊刚完成重组形成原始卵泡；在第5d的小鼠卵巢中，原始卵泡仍占有大部分比例，但也有大量的初级卵泡处于发育之中；在出生后第10d的卵巢中同时有原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的发育；老年小鼠（16个月大）卵巢中已基本没有卵母细胞.，
关键词：卵巢发育；生殖嵴；生殖包囊；卵泡
中图分类号：Q418；Q95-3 文献标识码：A 文章编号=1007-7847（2015）01-0044-05
PreliminaryStudiesofSeveralImportantDevelopmentalEventsinMouseOvary
LUOYang1，LILi1，LINGe2*
（1.CenterforReproductiveMedicine，ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity；KeyLaboratoryforRepro?ductiveMedicineofGuangdongProvince，Guangzhou510150，Guangdong，China；InstituteofReproductiveandStemCellEngineering，CentralSouthUniversity，ChangshaReproductiveandGeneticHospitalofCitic-Xiangya，Changsha410078，Hunan，China）
Abstract：Ovariesfrommiceatselectedstageswerestainingandcountingstatistics，todiscovertheirdevelo?pmentalcharacteristics.Theresultsindicatedthatmostofthegermcellswereproliferatingandexistingintheformofgermcystsinfemalegonadofembryodays12.5；Theday2ovarieshadmanyadjacentandclosedcontactedprimordialfollicles，whichindicatedthatthegermcellcystsjustcompletedtheprogrammedbreakdowntoformprimordialfollicles；Intheday5ovaries，therewerealargenumberofprimaryfollicles，hutprimordialfolliclesstilloccupiedmostly；Theday10ovarieshadthedevelopingprimordial，primaryandsecondaryfolliclesatthesametime；Theagedmouseovaries（16monthsold）almostpossessednooocytes.
Keywords：ovariandevelopment；genitalridge；germ
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：044?048）
由于哺乳动物生殖发育的保守性，人类卵巢发育的许多线索通常是先通过对小鼠卵巢发育的研究来获得的[1-3]。本文通过对基本贯穿小鼠生命周期的几个卵巢发育重要事件的研究，为小鼠卵巢发育乃至人类卵巢的相关研究提供一定的借鉴。
1材料与方法
1.1实验动物
C57bl/6j小鼠购自湖南斯莱克景达动物有限公司（中科院上海实验动物中心湖南分中心）。小鼠饲养条件为恒定温度下，12h的光照和12h的黑暗，提供充足的水和动物饲料；
孕鼠的获得：适育年龄的母鼠（8周左右），于下午2点左右进行孕马血清血促性素注射，48h后进行绒促性素注射，然后与适育年龄的公鼠（10周左右）以2：1进行同笼，次日早晨进行检栓，见栓小鼠以当日中午起记为第0.5d。所有小鼠的处死均采用颈椎脱位法杀死。
1.2主要实验试剂与仪器
注射用血促性素（孕马血清）和注射用绒促性素由浙江杭州动物药品厂提供；DPBS（Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline）、胎牛血清、Edu及相应检测试剂由美国Invitrogen公司提供；生殖细胞特异性标记MVH多克隆抗体及相应二抗由美国R&D公司提供；体视显微镜（SM2645）、倒置显微镜（TE300）以及免疫突光显微镜由日本Nikon公司提供。
1.3实验方法
1.3.1胚胎期第12.5d（E12.5）生殖嵴组织的取材及石蜡包埋
E12.5生殖嵴组织的取材为怀孕第12.5d的母鼠处死后，剥离取出胚胎置于100mm皿中，于体视镜下解剖取雌性生殖嵴组织。由于E12.5的生殖嵴组织需要进行细胞增殖检测实验，故需要在处死前进行Edu注射。具体方法为对怀孕第12.5d的孕鼠注射Edu溶液，3h后进行第2次注射，待3h后进行处死取材。
小鼠胚胎浸润于冰冷（4℃）DPBS中，洗涤去除血污，用细剪刀自上肢下方处剪除去掉胚胎的上部组织，保留下半部分胚胎；以钟表镊沿下半部胚胎的腹部中间夹开，挑出腹部的肝脏和肠子等杂质组织，后转至另一洁净的操作皿中，用冰冷DPBS冲洗干净后，用钟表镊轻柔地固定胚胎两侧，分离挑出胚胎体腹后壁两侧的雌性生殖嵴组织。镜下可从组织形态区别生殖嵴组织的性别：雄性生殖嵴组织相对粗而短，可见有分布于组织中的条纹；雌性生殖嵴组织相对细而长，可见有分布于组织中的斑点存在[4、5]。 取出的生殖嵴组织直接投入含有4%多聚甲醛的1.5mL的EP管中进行固定，置于4℃固定过夜。第二天用镊子取出固定好的生殖嵴组织，以包埋纸包裹好组织，然后进行组织石蜡包埋。
1.3.2第2d、5d、10d及老年期小鼠卵巢石蜡组织的制备
分别取出生后第2d、5d、10d小鼠，处死后，于显微镜下取出其卵巢组织，取出的卵巢组织以4%多聚甲醛固定，4℃过夜。第二天进行组织石蜡包埋。
由于老年小鼠卵巢组织需要进行细胞增殖检测实验，故需要在处死前进行Edu注射，具体方法同E12.5生殖嵴组织中操作。老年小鼠处死后，取出其卵巢组织，4℃固定过夜。第二天进行组织石蜡包埋。
1.3.3卵巢石蜡组织切片Edu免疫荧光染色及检测
Edu染色作为一种检测细胞有丝分裂的简便和有效方式，广泛用于细胞增殖的检测研究[6]。本研究中通过对活体小鼠进行Edu注射后，取其卵巢组织进行免疫荧光染色，以检测研究组织细胞的增殖状况。
制备的石蜡组织行4pm切片，然后进行抗原修复。实验时配置Edu染色液，吹打混匀后，避光反应30min，吸去反应液后，可直接于荧光显微镜下进行观察或继续进行其他免疫荧光染色
1.3.4卵巢石蜡组织切片MVH免疫焚光染色及检测
是仅特异性表达于生殖细胞中的基因，其在小鼠中同系基因为MVH（mouseVasahomo-logue，MVH）[7、8]。本实验中，将MVH作为生殖细胞的检测标记。
制备的石蜡组织行4μm切片，抗原修复后，胎牛血清封闭液封闭处理30min，吸去封闭液，加入以封闭液稀释的一抗MVH，浓度为8mg/L，置于4℃下孵育过夜；第二天，取出孵育的切片，于室温下复温30min，然后漂洗液漂洗5minx2次，加入稀释过的荧光二抗（1：1000），室温下避光孵育1h，吸去二抗，以漂洗液漂洗10minx3次，加入Dapi，避光10min，吸去Dapi，漂洗5minx2次后，于荧光显微镜下进行免疫荧光观察
1.3.5组织学观察和评价
将实验中的卵巢组织进行石蜡包埋和切片，HE染色后于高倍镜下进行评价和计数分析。卵泡分析参照Tilly等运用的标准，即由单层扁平的小颗粒细胞包绕着初级卵母细胞时称之为原始卵泡[1、9]；由单层立方柱状颗粒细胞包绕初级卵母细胞时为初级卵泡；多于两层少于四层立方状颗粒细胞包绕卵母细胞的卵泡为次级卵泡。
1.3.6数据分析处理
计量数据采用均数±标准差表示，用SPSS13.0软件对实验数据进行统计分析。
2结果
2.1生殖嵴期时的生殖细胞殖事件
我们对怀孕第12.5d时的母鼠进行Edu活体注射后处死，解剖分离出胎鼠的生殖嵴组织，发现不同性别胎鼠的生殖嵴组织巳有较明显的组织学区别。雄性生殖嵴可见弯曲管状结构，而雌性则出现斑点状特点（图1）：对分离得到的雌性生殖嵴组织进行免疫荧光染色（EDUWMVH免疫荧光染色）（图2），发现大量的生殖细胞（图2A）处于有丝分裂状态（图2B），经统计分析发现雌性小鼠中处于增殖状态的生殖细胞比例为83.14±5.2%（MVH与EDU双阳性细胞占MVH阳性细胞的比例。（图2C），故可认为此生殖嵴期的组织中有大部分生殖细胞处于增殖状态。
2.2生殖包囊细胞重组形成卵泡事件
在出生后2d的小鼠卵巢组织中，基本上已见不到生殖嵴组织中那样的生殖包囊，MVH染色发现大部分生殖细胞都呈现有完整边界的独立形态，但可见有较多的位置相邻较近的原始卵泡；而且相较于生殖嵴期，2d时卵巢组织的形态发生了显著的变化我们推测该时期刚由上个发育阶段中的生殖包囊完成重组形成原始生殖细胞。
对生殖包囊状况进行计数统计后，发现生殖嵴期组织中的生殖细胞绝大部分都是以生殖包囊的形式存在，而在出生后2d小鼠卵巢组织中，则都是形态上独立存在的原始卵泡（表1）。
2.3卵泡发育事件
在出生5d后的小鼠的卵巢组织中，生殖细胞较为均匀地分布于整个组织中，大部分都是形态是卵圆形的小卵泡（图3）；而在10d的小鼠卵巢中，则可见有许多卵圆形的小卵泡位于组织皮层，但由组织外缘向深处也存在有较多发育相对史'为成熟的大卵泡（图4）。经计数分析发现，2d小鼠卵巢中卵泡均为原始卵泡；到5d时，原始卵泡比例有了明显下降，但仍占据主要部分，此时出现了较多的初级卵泡，次级卵泡此时非常少；而在10d的卵巢中，原始卵泡的比例继续显著减少，而初级卵泡比例在上升，且此时出现了较多的次级卵泡（图5）。
2.4卵泡耗竭与卵巢衰老事件
我们发现老年小鼠（16个月大小）生理活动迟钝，毛发泛白且杂乱，同笼实验发现该年龄的小鼠已不具备生育能力。卵泡计数分析发现，老年小鼠卵巢中的生殖细胞数目已非常少，表明卵巢生殖细胞储备基本耗尽（图6A，D）；同时，卵巢中处于增殖状态的体细胞也很少（图6B）。这表明该老年小鼠的卵巢已完全衰老，不能发挥相应功能。
3讨论
实验中，发现生殖嵴期组织处于活跃的增殖状态，由于生殖细胞的增殖活动仅在该期进行，所以该阶段生殖细胞的增殖影响着卵巢中卵子所能达到的最大数目。
同时生殖嵴期时候生殖细胞大多以包囊形式存在，而在2日龄小鼠卵巢中，基本上均为形态独立的卵泡细胞，表明小鼠出生前后卵巢组织中会发生大的形态变化，生殖包囊解体，与周围体细胞重组形成卵泡。生殖细胞的数量与前阶段也有一个显著的下降，并且形成的卵泡构成了卵巢中的卵泡储备。至于在生殖包囊解体形成单个卵泡的过程中如何进行细胞质的交流和细胞器的分配，以及这些活动对生殖细胞的影响则有待进一步研究[10、11]。
在2日龄小鼠卵巢中的卵泡基本上均为原始卵泡，到第5日龄卵巢中时，卵巢中出现一定数量的初级卵泡和少量的次级卵泡，到第10日龄时候，原始卵泡的数量显著减少，而初级卵泡比例在上升，此时也出现了较多的次级卵泡。且可见原始卵泡均集中于卵巢边缘，而初级卵泡和次级卵泡则由皮质向髓质呈指向分布，由此可以推测卵泡的发育存在一定的路径选择。