苜蓿是世界上栽培最早、面积最广的多年生豆科植物[1]，是一种优质、高产、高蛋白、适应性强的豆科牧草，它在传统农业中发挥着提供饲草和培肥土壤的作用。长期以来人们对苜蓿的营养价值和产量等方面进行了大量的研究[2-4]。不同种植年限的苜蓿使土壤理化性质和生物学性状发生了不同的变化，在一定程度上影响了土壤的肥力状况，进而影响到了其营养价值、产草量等问题。土壤微生物是土壤生态系统中极其重要和最为活跃的部分[5]，在土壤养分转化循环，系统稳定性和抗干扰能力以及土壤可持续生产力中占据主导地位[6，7]，因此土壤微生物种类、数量及其变化在一定程度上反映了土壤有机质的矿化速度以及各种养分的存在状态，从而直接影响土壤供肥状况[8]。目前，关于研究不同种植年限苜蓿地参与氮素循环的微生物生理群的分布特征研究较少，对不同种植年限苜蓿地的亚硝化细菌、反硝化细菌和固氮菌分布特征的研究更少，研究这些土壤微生物目的在于培肥土壤和实现土壤可持续利用提供科学依据。
1材料与方法
11材料
试验地点位于西辽河平原内蒙古民族大学试验农场，土壤类型为灰色草甸土，苜蓿品种为阿尔冈金，试验对象为2年生和5年生苜蓿，栽培管理一致，对照为毗邻试验田的非苜蓿地。2006年4月9日和5月23日先后两次对2年生、5年生苜蓿地和对照地块分别按0～10cm，10～20cm，20～30cm和30～40cm 4个土层分层采样，3次重复，采集土壤样品装入灭菌处理过的聚乙烯袋中于实验室4℃低温保存，以备用。试验固氮菌采用改良瓦克斯曼（Waksman）77号培养基，亚硝酸细菌采用改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培养基，反硝化细菌采用培养基4[9]。
12方法
固氮菌采用固体平板法计数，亚硝酸细菌和反硝化细菌采用稀释法[9]，固氮菌改良瓦克斯曼77号培养基在28～30℃恒温箱中培养7天计数，亚硝酸细菌改良的斯蒂芬逊培养基和反硝化细菌培养基在28～30℃恒温箱中培养14天计数，查表后换算成每克干土的含菌数。
2结果与分析
21土壤亚硝酸细菌
土壤的硝化作用是在硝化细菌作用下将氨转化成硝酸的过程，土壤中硝化细菌的多少反映了土壤硝态氮的供应状况。土壤中硝化细菌数量的测定通常只测定亚硝酸细菌的数量，原因在于土壤中硝化作用的第一阶段和第二阶段是连续进行的，一般很少有亚硝酸盐的累积，所以测定参与第一阶段的亚硝酸细菌的数量，就能反映出硝化细菌的多少。由表1可以看出，0～40cm的4个土层中，苜蓿地的每个土层在4月份亚硝酸细菌都高于对照的每个相应土层3个数量级，在5月份的亚硝酸细菌低于对照的每个相应土层1个数量级。2年生苜蓿地的亚硝酸细菌数量多于对照，5年生苜蓿地的亚硝酸细菌数量少于对照。
从总体上看苜蓿地的亚硝酸细菌在4月份明显高于5月份，2年生苜蓿地亚硝酸细菌数量从上到下4个土层在4月份先减后增，5月份逐渐减少呈下降趋势。5年生苜蓿地亚硝酸细菌数量从上到下呈先升高后下降的趋势。2年生苜蓿地中亚硝酸细菌在4月份的20～30cm土层所占比例最大，在30～40cm土层所占比例最小，5月份的亚硝酸细菌在0～10cm土层所占比例最大，30～40cm土层中比例最小。5年生苜蓿地中，亚硝酸细菌数4月份在0～10cm土层所占比例最小，5月份在10～20cm土层所占比例最大。
22土壤固氮菌
土壤固氮菌对土壤氮素平衡起着调节作用，并且其在土壤中的数量多少与土壤中的氮素养分含量有密切关系。由表2可见，在0～10cm土层中，2年苜蓿地的固氮菌数量多于对照，4月份和5月份分别增加了263%和638%。5年生苜蓿地固氮菌数量少于对照，4月份和5月份分别减少了524%和552%；在10～20cm土层，2年生苜蓿地的固氮菌数量都低于对照，4、5月份分别减少了64%、58%。5年生苜蓿地的固氮菌在4月份增加了344%，5月份減少了53%；在20～30cm土层，苜蓿地中，2年生的固氮菌数量在4、5月份分别比对照减少了418%、571%；5年生的固氮菌数量4月份比对照增加了122%，5月份比对照减少了571%；在30～40cm土层，苜蓿地的固氮菌书都低于对照，分别减少了287%、513%和894%。总体上看，苜蓿地的固氮菌数少于对照。
从垂直分布上看，2年生苜蓿地的固氮菌数量在0～10cm土层中所占比例最大，且都大于对照相应土层的比例。5年生苜蓿地的固氮菌数量在10～20cm土层中所占比例最大，在0～10cm，30～40cm土层中比例较少，且小于对照相应土层的比例，从上到下4个土层的固氮菌数量比例先增加后减少。
23土壤反硝化细菌
土壤的反硝化作用是指土壤中的硝态氮在反硝化细菌的作用下转化为气态氮的过程。因此，土壤中的反硝化细菌在一定条件下会造成土壤的氮素损失，从而影响土壤的肥力状况，这与反硝化细菌数量的多少密切相关。由表3可以看出，在0～10cm土层和10～20cm土层，苜蓿地的反硝化细菌都明显少于对照，且相差数目很大，2年生和5年生苜蓿地的反硝化细菌数相差较小；在20～30cm土层，2年生苜蓿地的4月和5年生苜蓿地的4月和5月的反硝化细菌数分别比对照减少了632%、929%、776%，而2年生苜蓿地4月份比对照增大了7倍；在30～40cm土层，2年生和5年生苜蓿地的反硝化细菌数都比对照有所减少，分别减少了143%、643%、8236%。总体来看，苜蓿地的反硝化细菌数都少于对照。
垂直分布上，2年生苜蓿地4月份和5年生苜蓿地的反硝化细菌数比例从上到下呈下降趋势。2年生和5年生苜蓿地在4月份和5月份的反硝化细菌数比例大小基本一致。2年生苜蓿地5月份 0～10cm和30～40cm土层的反硝化细菌数所占比例极小，10～20cm，20～30cm土层的反硝化细菌数所占比例较大，5年生苜蓿地的4 个土层反硝化细菌数所占比例大小无明显差别。
3结论
土壤亚硝酸细菌在2年生苜蓿地和5年生苜蓿地中的大小变化幅度不尽相同，但苜蓿地在4月份亚硝酸细菌远大于5月份的亚硝酸细菌数，这可能是由于土壤环境条件导致上一年残留的累积，致使其数量升高，这还有待于进一步研究。苜蓿地固氮菌都低于对照，且在2年生和5年生苜蓿地中无明显差异。反硝化细菌在2年生和5年生苜蓿地中都低于对照，但2年生的都多于5年生的，这与邰继承[10]研究一致，说明紫花苜蓿随着种植年限增加能够有效改善土壤通气状况，降低土壤氮素损失。2年生和5年生苜蓿地中反硝化细菌在5月份都高于4月份，其原因是土壤反硝化细菌数量受温度和干湿度季节的影响，夏秋高温和雨季情况下土壤反硝化细菌数量增多有关，苜蓿耐低温且对水分和热量敏感[11，12]，多年的气象资料显示，试验区4月份尚处于终霜期[13]，5月份气温逐渐升高[14]，以及该地区降水主要集中在5～9月[15]有关。试验结果表明总体上苜蓿地的反硝化细菌数量最多、固氮菌次之，亚硝酸细菌较少，表明温度和降水等气候条件是影响西辽河平原苜蓿地土壤3类菌变化的重要因素，进而土壤氮素循环过程。西辽河平原在温度升高、降水减少、干旱加重以及井灌农业对当地水资源持续消耗的背景下[16]，对于苜蓿地多年的土壤氮素循环影响还需进一步深入研究。