左卡尼汀是一种氨基酸衍生物，又称左旋肉碱，是哺乳动物能量代谢必需的体内天然物质，其作用主要为促进脂质代谢。左卡尼汀注射液在临床上应用广泛，效果良好，是治疗心力衰竭的首选药物，主要用于慢性肾衰竭及血液透析者肉碱缺乏性疾病，目前己被美国药典和我国国家药品标准目录收载。但我国现有制剂标准中，并未设定其有关物质的检查项。目前的研究中，也多以左卡尼汀及杂质A为主，未见其他杂质的相关报道。我国的新药研究领域，有关物质逐步引起人们的重视，为提高用药安全性，在研发过程中通常需对原料和制剂中的有关物质进行详细的研究。欧洲药典和英国药典收载的左卡尼汀原料药质量标准中，列出了其中常见的4种杂质，即杂质A,杂质B、杂质C和杂质D，但仅对杂质A的量进行了限定(不超过0.5%)。两部药典中所用色谱柱为丙胺基甲基硅烷基键合硅胶柱，柱子填料和规格在国内并不常见。经本课题组验证，使用该两部药典中的色谱条件无法使主峰与杂质A峰完全分离，且无法有效区分杂质B,C和D。故本研究建立一种可同时用于左卡尼汀含量和各有关物质的测定方法，使左卡尼汀主峰、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D5个色谱峰均能完全分开，以提高药品的质量标准和安全性，为该品种的研发及质量标准的建立和提高提供保证。
1仪器与试药
岛津分析型高效液相色谱仪(二极管阵列检测器、二元高压梯度泵、真空脱气机、柱温箱、自动进样器;色谱工作站);超声波清洗器(南京垒君达超声电子设备有限公司);METTLER实验室pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司);METTLER XS105型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
对照品左卡尼汀(批号L0399900)、杂质A(批号L0399905)、杂质B(批号1418-064A1)、杂质C(批号1394 - 016A2)购于欧洲药品质量管理局，杂质D(批号MS200705-OS A)购于深圳德博瑞生物科技有限公司，纯度均大于98%;左卡尼汀原料药(批号0171302002)，购于东北制药集团股份有限公司;左卡尼汀注射液(3批中试放大注射液由悦康药业集团有限公司生产，其他由北京中医药大学中药现代研究中心研制)。乙腈为色谱级，水为超纯水，其他为分析纯。
2方法与结果
2. 1溶液的配制
2.1.1供试品溶液I 精密吸取左卡尼汀注射液0. 5 mL于50 mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
2.1.2供试品溶液II 精密吸取左卡尼汀注射液0. 5 mL于10 mL量瓶中，用流动相稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
2.1.3对照品储备液分别称取左卡尼汀、杂质A、杂质B、杂质C和杂质D的对照品适量，精密称定，加流动相制成质量浓度分别为2. 62 , 87. 40 ,56. 00 , 44. 80和50. 80 g/mL的溶液，摇匀，即得。
2.1.4对照溶液精密吸取供试品溶液II 10 L于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
2. 2色谱条件
采用Alltech Brava Amino色谱柱(250 mm x4. 6 mm, 5m )，流动相为0. 01 mol/ L磷酸盐缓冲液-乙腈(25 : 75 )，流速1. 0 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长205 nm，进样量10 L 。
2. 3系统适用性试验
按上述色谱条件，左卡尼汀峰与杂质峰分离度大于1. 5，理论塔板数按左卡尼汀计大于3 000。
2. 4专属性考察
分别精密称取5份左卡尼汀原料药适量，置于25 mL量瓶中。取2份分别加入1.0 mol/L盐酸和1. 0 mol/ L氢氧化钠溶液各5 mL，室温放置1h后中和并加流动相至刻度;取1份加入30%过氧化氢溶液8滴，室温放置1 h后加流动相至刻度;最后2份分别加入1.0 mol / L盐酸和1.0 mol/L氢氧化钠溶液各5 mL，放置于烘箱(57 ℃)0.5 h后中和，加流动相至刻度。上述5份处理过的样品摇匀静置，滤过，取续滤液进样测定。左卡尼汀原料药在碱加热破坏情况下可产生杂质A，在其他条件下并无明显杂质出现。各杂质峰与左卡尼汀峰分离良好，表明该色谱条件适用于有关物质的测定。
2. 5检测限和定量限
将2. 1. 3项下对照品储备液用流动相逐步稀释成不同浓度，注入液相色谱仪，分别以信噪比3: 1和10: 1为标准测定各成分的检测限和定量限。
2. 6线性关系考察
分别精密吸取左卡尼汀及各杂质的对照品储备液，加流动相制成不同浓度的系列对照品溶液，精密吸取10 L注入高效液相色谱仪，以各自的峰面积A对其浓度C进行线性回归。结果表明左卡尼汀及各杂质在其各自浓度范围内线性关系良好。
2. 7精密度试验
2. 7. 1日内精密度按2.1.1项下方法配制供试品溶液16份，按2. 2项下色谱条件连续进样6次，计算左卡尼汀峰面积的RSD (n =6)为1. 1%。精密量取2.1.3项下各杂质对照品储备液，分别按2. 2项下色谱条件连续进样6次，结果左卡尼汀、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D峰面积的RSD ( n =6)依次为1.1%,0.42%,0.98%,1.5%,1.5%。结果表明仪器的精密度良好。
2. 7. 2日间精密度分别精密量取供试品溶液I和各杂质对照品储备液，按2. 2项下色谱条件连续3d进样，每日进样2次，结果左卡尼汀、杂质A,杂质B、杂质C、杂质D峰面积的RSD (n =6)依次为0.72%,0.30%,12.3%,2.7%,2.1%，结果表明仪器的精密度良好。
2. 8稳定性试验
精密量取供试品溶液I，室温放置，分别按2. 2项下色谱条件于0,2,4,6,8,12 h进样测定，结果左卡尼汀峰面积的RSD为0. 22%。表明供试溶液在12 h内稳定。
2.9回收率试验
2. 9. 1左卡尼汀加样回收率取供试品溶液I 3份，分别加入左卡尼汀低、中、高3种质量浓度(相当于供试品溶液I中左卡尼汀量的80%,100%,120%)的对照品溶液，摇匀，即得供试溶液。按2. 2项下色谱条件每种质量浓度的供试溶液连续进样3次，记录色谱峰面积，结果见表2。低、中、高3种质量浓度的平均回收率(n = 9)为100.0% ( RSD =0. 93%)。2. 9. 2杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的回收率分别精密称取杂质A,B,C,D对照品1. 10, 1. 38,1.94,1.58 mg于50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制得各供试溶液(视为浓度100% )。并以此配制80 % ,120%浓度的供试溶液。每个浓度的供试溶液分别按2. 2项下色谱条件连续进样3次，记录色谱峰峰面积并计算其回收率。结果杂质A、杂质B、杂质C、杂质D的平均回收率(n=9)分别为100.1% (RSD =0.53%) ,101.6%(RSD=6. 0 %)、95.7%(RSD=3. 6%)、102.5 %(RSD=2. 1%)。
3含量测定及其有关物质测定
取中试放大的3批左卡尼汀注射液，分别按2.1.1 , 2.1. 2及2.1.4项下方法制备供试品溶液I、供试品溶液II及对照溶液，按2. 2项下色谱条件进样分析，以外标法计算左卡尼汀和杂质A含量，以自身对照法计算其他杂质含量.
4讨论
4. 1氨基柱的使用及色谱峰的分离
在本研究所建立的色谱方法中，用前充分平衡色谱柱以及柱温的选择是有效分离的关键。将氨基柱作为反相色谱柱使用，存在表面键合基团易流失的问题，故对于新的色谱柱，需使用不含盐的流动相进行24 h以上的平衡，否则会出现保留时间偏移等问题;另外，柱温对左卡尼汀和杂质A的分离度有明显的影响，在柱温40℃时，两者的分离度可达到1. 5以上，实现完全分离。而在美国药典中，两者所规定的分离度为1.20
4. 2缓冲盐浓度的选择
文献[报道左卡尼汀分析方法对流动相的pH要求严格，需调节至4. 70使用，故流动相宜采用缓冲盐系统。在本研究中，对比了不同浓度的磷酸盐缓冲液(0. 01~0. 05 mol / L)，结果发现，在未调节pH的情况下，缓冲盐浓度对出峰情况没有明显的影响。从节约色谱柱和仪器寿命角度考虑，本实验选择了0. 01 mol/ L的磷酸盐缓冲液。这是目前己有报道的左卡尼汀分析方法中磷酸盐浓度的最低值。
4. 3色谱条件的确定
研究过程中曾采用国家药品标准左卡尼汀注射液含量测定方法，常规C,、色谱柱，使用离子对试剂作为流动相，将混合对照品溶液注入高效液相色谱仪，结果发现左卡尼汀与杂质A分离度较差，杂质B、杂质C和杂质D与溶剂峰混在一起，无法分离，且流动相的配制较烦琐。故在本研究中，最终采用常规氨基柱，在对柱温(30,35,40 ℃)、流速(0. 8 ,1.0,1.2 mL /min)、水相比例(20%,25%,30%,35%)进行对比研究的基础上，确定了2. 2项下色谱条件。
5结论
本文建立了优化的左卡尼汀注射液含量测定和有关物质检测的HPLC法，并对该方法进行了完整的方法学验证。通过以上试验结果表明，所建方法专属性、精密度、线性与范围、准确度均符合要求，能够准确地对左卡尼汀注射液进行含量测定及有关物质的分析。该方法克服了国外药典中色谱柱不易得、国家药品标准中流动相配制烦琐、杂质B,C,D分离度不好等多个问题，可使左卡尼汀及4个相关杂质峰得到较好分离和定量测定，可为左卡尼汀注射液质量控制和质量标准的建立提供可靠手段。