病毒性、药源性、酒精性肝炎在人群中发病率很高, 这些肝炎均存在程度不一的肝损伤和肝纤维化(hepatic fibrsis, HF), 肝纤维化是慢性肝炎发展到早期肝硬化的必经阶段。研究发现, 肝纤维化甚至早期肝硬化都是可以逆转的, 因此促进了保肝药和抗肝纤维化药物的研究开发。金线莲(HerbaAnoectoch ili )为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰的全草, 在民间素有药王、神草、乌人参等美称,其性甘、平, 具有清热凉血、固肾平肝、祛风利湿等功效。其野生资源稀少, 是一味名贵珍稀的中草药。近年来, 组培技术的研制和发展, 解决了金线莲的药源稀缺, 大大促进了金线莲的研究开发。据报道, 台湾金线莲(A. formosanus )和高雄金线莲(A. koshunensis )具有肝障凝之保肝作用, 而福建金线莲(A. roxburghii )肝保护作用研究尚未见报道。本实验拟对福建金线莲进行初步提取, 观察其对肝损伤的保护及肝纤维化的防治作用, 为金线莲在肝病防治方面的临床应用提供参考。
1 材料
1. 1 药物与试剂
金线莲鲜草[ Anoectoch ilusroxburgh ii (W al.l ) lind.l ] (产于福建省福州市闽侯县白沙镇, 中国科学院植物研究所郎楷永研究员和福建师大生物系林来官教授鉴定, 福州佳乐达生物工程有限公司);益肝灵片(含水飞蓟素38. 5mg /片, 上海汉殷药业有限公司, 批号040302);ALT、AST生化测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司);CC l4 为分析纯;其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器与动物
AV2700全自动生化分析仪(日本M ishima OLYMPUS 公司);LABOROTA 4001低温真空浓缩仪(德国He ido lph Instrument公司)。清洁级ICR小鼠, ♀♂各半, 体重18 ～ 22g[福建医科大学动物实验中心, 动物合格证号:SCXK(闽)2004-0002] 。
2 方法
2. 1 金线莲提取液的制备
(1)水煎液 金线莲新鲜全草, 加蒸馏水, 煎煮3次, 滤过, 合并滤液浓缩成膏状。
(2)醇提液 取金线莲新鲜全草, 置真空干燥机中以60℃干燥, 加入95%乙醇适量, 80℃水浴回流3次, 滤过, 合并滤液浓缩成膏状。
(3)全草榨汁液 取金线莲新鲜全草, 洗净榨汁, 迅速以低温真空浓缩。
2. 2 金线莲提取液对小鼠急性肝损伤的影响
采用小鼠ip 0. 1%CC l4 的蓖麻油溶液制作急性肝损伤模型。小鼠随机分成9 组, 每组20 只, 分别为正常组、模型组、益肝灵组、水提低、高剂量组、醇提低、高剂量组, 榨汁低剂量、高剂量组。ig给药, qd, 连续3d。益肝灵组用益肝灵片制成悬液, 按水飞蓟素含量以0. 5g kg -1体重的剂量给小鼠ig。非给药组ig生理氯化钠溶液。于末次给药后2h, 除正常组外,其余各组小鼠ip 0. 1%CC l4 油溶液(10 m l kg -1体重), 正常组ip等体积蓖麻油。禁食不禁水, 24h后全部小鼠摘眼球取血, 离心, 取上层血清测ALT、AST。采血后, 迅速解剖, 取出肝脏, 在同一肝小叶上取一小块肝组织放入10%甲醛溶液固定, 作HE染色, 光镜下观察其病理组织学变化。
2. 3 金线莲提取液
对小鼠慢性肝损伤及早期肝纤维化的影响 以苯巴比妥钠溶液(350mg L-1 )为饮用水饲养小鼠2周, 诱导肝药酶;第3周给小鼠ig 50%CC l4的蓖麻油溶液(20m l kg-1体重), 1次/5d, 连续5周, 制作慢性肝损伤模型。小鼠随机分成4组, 每组20只, 分别为正常组、模型组、高、低剂量金线莲榨汁组。模型组和给药组ig 50%CC l4 的蓖麻油溶液, 正常组ig 等体积的蓖麻油。给予CC l4 的同时开始ig给药, qd, 非给药组ig 生理氯化钠溶液。于末次给CC l4 24h后采血, 测血清ALT、AST。解剖取肝、脾和胸腺称重。取肝组织作网状纤维染色检查。
2. 4 数据处理
采用SPSS 11. 1统计软件处理数据, 分析数据的组间差异。
3 结果
3. 1 金线莲提取物对小鼠急性肝损伤生化指标及肝组织学的影响
3. 1. 1 金线莲提取物对急性肝损伤生化指标的影响
金线莲榨汁组小鼠血清中的ALT、AST水平分别低于模型组的30%和45%(P 0. 01), 与益肝灵组无显著性差异, 接近正常组水平。此外, 金线莲的水煎、醇提和榨汁组的ALT、AST值之间亦无显著性差异。提示金线莲3种不同提取液在剂量为1. 0和5. 0g kg- 1时对CC l4 引起的小鼠血清转氨酶升高均具有抑制作用。
3. 1. 2 金线莲提取物对急性肝损伤肝组织学的影响
CC l4 模型组中, 小鼠肝细胞排列紊乱, 伴有炎症细胞浸润, 并呈不同程度的胞浆疏松、气球样变。金线莲各给药组和水飞蓟素组肝细胞大小较一致,其肝细胞肿胀、坏死和炎症细胞浸润程度明显轻于模型组。
3. 2 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠生化指标、肝组织学及免疫器官形态学的影响
3. 2. 1 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠肝生化指标的影响 金线莲组小鼠血清中的ALT、AST水平分别低于模型组的45%和40% (P 0. 01), 接近正常组水平。提示金线莲具有降低慢性肝损伤小鼠的血清转氨酶的作用。
3. 2. 2 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠肝组织学的影响 CC l4 模型组中, 小鼠肝细胞排列紊乱, 增生的纤维组织形成粗大的条索部分已经互相连接形成间隔, 已形成肝硬化早期的特征。金线莲组的肝组织变化轻于模型组, 增生的纤维组织形成小的条索但尚未互相连接形成间隔。
3. 2. 3 金线莲榨汁液对慢性肝损伤小鼠免疫器官形态学的影响 模型组的肝/体重、脾/体重比值明显高于正常组(P 0. 01), 而胸腺/体 重比值低于正常组(P 0. 01), 提示反复给予CC l4 后小鼠的肝脾明显肿大, 而胸腺萎缩;高低剂量金线莲组的肝/体重、脾/体重比值均明显低于模型组(P 0. 01), 而胸腺/体 重高于模型组, 与正常组较为接近。另外, 解剖发现模型组小鼠的肝脏表面粗糙, 而金线莲组小鼠的肝脏表面比较光滑。说明金线莲对CC l4 造成小鼠部分脏器的损伤具有保护作用。
4 讨论
4. 1 CC l4 肝损伤的作用机制
CC l4 进入体内经肝药酶P-450激活, 产生自由基, 与肝细胞生物膜上的脂质起过氧化反应, 生成脂质过氧化物, 同时引起C a2 +的内流, 使细胞膜结构和功能受到破坏, 导致肝细胞中ALT、AST 释放入血, 使血中ALT、AST 升高。本实验表明, 金线莲提取物能明显降低小鼠CC l4 肝损伤模型的ALT、AST, 这提示金线莲可能是通过清除自由基、稳定细胞膜而对肝细胞起到保护作用的。有研究表明, 金线莲对于以CC l4 诱发的大鼠原代培养肝细胞的损伤有明显保护作用。此外, 台湾学者[ 7]报道金线莲提取物能够对抗FeC l3-维生素C 导致的小鼠肝脂质过氧化, 同时对黄嘌呤氧化酶所致的小鼠过氧化物和自由基都有较好的清除作用。这与我们的实验结果相一致, 但金线莲肝保护作用的靶点和机制尚未确定,还有待进一步研究。
4. 2 CC l4 慢性肝损伤并诱导早期肝纤维化是经典动物模型
单纯给予小鼠高浓度CC l4 , 形成肝纤维化的时间较久, 动物死亡率较高, 且肝纤维化的持续时间较短。在给CC l4 前2周, 先用苯巴比妥钠溶液作为饮用水诱导小鼠肝药酶, 再给小鼠ig CC l4 , 使小鼠较快形成肝纤维化, 减少CC l4 用量, 死亡率降低, 并且缩短造模时间, 肝纤维化的持续时间也较长。另外, ig给予CC l4 与sc和吸入法比较, 其优点在于CC l4 可直接经门静脉到达肝, 1. 5h 肝内即可达最高水平, 比较贴近临床病理过程。
4. 3 金线莲主要有效成分
为多糖近年来, 金线莲的药理活性日益受到关注, 对其化学成分的研究也日渐兴起。据报道，已从金线莲中分离到一些新的化学成分, 其生物活性有待研究。本实验采用水煎、醇提、榨汁3种方法制备金线莲粗提液。水煎法和榨汁法可提取到多糖成分, 而在醇提液中不含或含较少多糖成分。实验结果显示这3种提取液在对抗CC l4 所致的肝损伤方面的作用无明显差别。提示金线莲中保护肝细胞的有效成分可能不只是多糖类成分。但对金线莲中有效成分的研究需要进一步的分离纯化。
4. 4 目前抗肝纤维化
药物作用的环节主要有:抑制或减轻炎症反应;抑制肝星状细胞激活;促进肝脏细胞再生;保护肝细胞阻止其凋亡;抑制或中和细胞因子活性;抑制细胞外基质合成及分泌和增加瘢痕性基质降解。研究发现, 许多中药复方和有效成分有抗实验性肝纤维化作用, 甘草甜素、氧化苦参碱等已试用于临床, 效果较为满意。这些中药有效成分大多有减轻肝脏炎症或促进肝细胞再生, 减少肝脏胶原沉积,促进肝脏胶原降解等功能。目前认为, 金线莲的肝保护作用可能是通过清除自由基、稳定细胞膜等环节。说明金线莲可通过抑制肝细胞受损, 从而延缓由此继发肝纤维化的病理进程, 对临床上早期肝纤维化有一定的防治作用。本课题下一步的工作将研究金线莲对肝纤维化各具体环节的作用。