【关键词】双相系统；分枝杆菌；雄烯二酮；植物甾醇；表面活性剂
微生物降解甾醇的工作开始于20世纪60年代，已发现多种微生物可将植物甾醇侧链选择性的切除得到AD[3]。微生物法生产AD主要受甾醇在水中溶解度低的限制，甾醇在水中的溶解度低于2mg/L，产物AD在水中的溶解度也不高于50mg/L[4]，甾体化合物的难溶性是限制微生物转化工业化最主要的障碍之一。传统的单水相发酵多采用添加少量有机溶剂、表面活性剂的方法来提高甾醇在发酵液中的溶解度，效果并不理想，而且有机溶剂等对细胞产生毒性以及对安全、环保等因素影响，从而制约了其在工业化上的应用。采用大豆油/水双液相发酵系统，可以有效增加甾醇的溶解度，提高底物投料量，而且减少了对细胞的毒性。本文主要研究了大豆油在发酵液中所占比例，植物甾醇的投料量以及添加表面活性剂对植物甾醇转化率的影响。
一、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
分枝杆菌Mycobacterium sp-XHL-501（上海新华联制药有限公司菌种室保藏）。
甾醇为进口甾醇，大豆油购于上海良友海狮油脂实业有限公司，吐温80购于上海申宇医药化工有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
种子培养基（g/L）：葡萄糖 8；玉米浆 65；酵母膏 4；NaNO3 5；（NH4）2HPO4 0.5，灭菌后pH6.8-7.2。
美国安捷伦1260高效液相色谱仪；上海国强生物工程有限公司3L玻璃发酵罐、15L不锈钢立式发酵罐。
1.3 方法
1.3.1 斜面培养
将菌种接种到斜面培养基，30℃培养箱内培养3天。
1.3.3 发酵转化培养
1.3.4 转化率计算方法
二、结果与分析
2.1不同比例的大豆油对甾醇转化率的影响
2.2不同投料量对甾醇转化率的影响
2.3不同比例吐温-80对甾醇转化率的影响
表面活性剂的分子结构与细胞膜相似，在微生物转化过程中，它可以增加底物的溶解度，同时改变细胞膜的通透性。吐温80是一种常见的水包油型表面活性剂，试验证明在大豆油/水双相发酵培养基中添加吐温80可有效提高甾醇转化率，投量为0.2%时，转化率可达到85%左右。低于该浓度，其对甾醇的溶解能力及对细胞膜通透性影响较小，而高于该浓度，则破坏细胞膜通透性，转化率均不能达到理想水平。
2.4正交试验
根据单因素试验结果，选择大豆油投料浓度，底物甾醇投料浓度和吐温80投料浓度3因素，以AD转化率为考察指标，设计L9（3）4正交试验，正交试验设计及极差分析见表2，方差分析见表3。
方差分析结果可以看出，三因素对转化率均有影响，都不显著。但是与其他发酵系统相比，甾醇的转化率有较大提高，优化试验对大规模化生产具有一定指导意义。
三、结论
（1）构建大豆油/水双液相发酵系统，可以有效解决甾醇难以溶解乳化的问题，与传统单水相发酵相比，不仅产率有大幅提高，且更安全、环保。
（2）在大豆油/水双液相发酵系统中，研究了大豆油在发酵液中所占比例、甾醇投料浓度以及添加表面活性剂如吐温80等因素对产物转化率的影响，对AD的工业化生产具有一定的指导意义。
参考文献