血虚是体内阴血亏损的病理现象，可由失血过多，或久病阴血虚耗，或脾胃功能失常，水谷精微不能化生血液等所致。李东垣在《脾胃论饮食劳倦所伤始为热中论》云：有所劳倦，行气衰少，谷气不盛，上焦不行，下脘不通，胃气热，热气熏胸中，故曰内热，又云：惟当以辛甘温之剂，补其中而升其阳。通过血虚证中医学的定义和古籍文献的描述可知，血虚多由失血、劳倦、饮食不足等原因所致。本文通过负重游泳劳倦、眼眶放血、控制饮食的综合造模法，制备新的血虚证小鼠模型，以期为临床验证补血方药提供借鉴和帮助。
1 材料
1.1 动物昆明种健康小鼠(Mus Musculus)50只，雌雄各半，体重在18~22 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。
1.2 仪器全自动血球计数仪(型号：F-820)，日本岛津有限公司;精密电子天平(型号：FA1004)，上海恒平科学仪器有限公司。
2 方法
2.1 实验条件实验室与饲养室均由山东中医药大学中医综合实验室提供，室温20~25 ℃，湿度45%~55%，通风及光照条件良好，颗粒饲料由山东中医药大学实验动物中心提供，每日更换饮水瓶内饮水和垫料。
2.2 造模方法综合造模方法[2-3]包括负重游泳劳倦、眼眶放血、控制饮食，造模时间共持续2周(14 d)。负重游泳劳倦具体方法是指：每天上午10：00和16：00进行负重游泳，负重重量为体重的10%。强迫小鼠在温水池中游泳2次，每次游泳时间不限定，以小鼠整体下沉于水面6 s为限，持续2周(14 d)。温水池水温控制在19 ℃，水深控制在20 cm。眼眶放血[4]具体方法是指：用左手固定小鼠，轻轻对颈部施加压力，使头部静脉淤血后，在突出的眼球旁找出后眼眶静脉，然后将少量10%可卡因滴入小鼠眼睛内，使眼部局部麻醉;右手持消毒的毛细吸管自内侧眼角平行鼻侧眼眶向喉头方向轻压，刺破后眼眶静脉丛，血液自然吸入管内，放血6~8滴(约0.5 mL)，放血后拔出毛细吸管，给予小鼠头部冷水刺激，血液自然停止。然后用棉签将小鼠眼部周围的血迹擦拭干净，防止血腥味引发小鼠间撕咬。隔日重复1次。控制进食具体方法是指：自造模之日起控制小鼠的进食量，按照每日75 g/kg体重喂料。
2.3 动物分组将实验用小鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别为空白组、劳倦放血组、限食劳倦组、限食放血组、综合造模组。空白组不进行任何处理，保证其充足的食物与饮水。各组小鼠雌雄分开饲养。
2.4 观察指标(1)一般情况：造模期间，观察空白组及各造模组小鼠的精神状态、行为反应、运动情况、皮毛光泽、眼睑唇鼻等方面的变化情况。(2)体重：各造模组连续造模2周(14 d)，测量造模前、造模后每天的小鼠体重，并做记录，观察不同造模方法对小鼠体重的影响。(3)脏器系数：连续造模2周(14 d)后，称取小鼠体重。经眼球取血后，处死小鼠，解剖并分离出小鼠胸腺、肝脏、脾脏、肾脏，洗去血污，除去系膜及脂肪，称量各脏器的质量。根据脏器系数的公式计算各组的脏器系数(4)血常规：连续造模2周(14 d)后，经眼球取血20 L后，将血液放入抗凝液中，混匀后用全自动血球计数仪检测血中的红细胞、白细胞及血小板等指标。2.5 统计学方法所有数据用xs表示，应用SPSS17.0统计学软件进行处理数据，不同组间比较采用方差分析，以P0.05为显著性差异。
3 结果
3.1 对一般情况影响的表现在连续造模期间，空白组小鼠体重明显增加，精神活跃，动作敏捷，皮毛光泽，密集，体态丰满，耳廓鼻唇颜色细腻，呈现淡红色，背腰平直。劳倦放血组小鼠体重明显减轻，精神明显烦躁，动作迟缓，部分蜷卧，皮毛稀疏，尤其在游泳后能够明显观察到，鼻唇淡白色，光泽较差，耳廓呈现淡白色，团缩，弓背明显，明显消瘦。限食劳倦组小鼠体重明显减轻，精神萎靡，动作迟钝，皮毛无光泽，稀疏，体型瘦弱，耳廓鼻唇颜色异常，呈现淡白色，腰背弯曲。限食放血组小鼠体重减轻，精神不振，动作比较迟钝，皮毛无光泽，耳廓鼻唇颜色呈现淡白色。综合造模组小鼠体重明显减轻，精神萎靡，动作迟缓，皮毛稀疏，无光泽，体型明显消瘦，耳廓鼻唇颜色淡白，腰背不直。
3.2 对体重的影响造模前，各组间小鼠体重无显著性差异。连续造模2周(14 d)，每天称取小鼠体重。结果显示，造模后第4天、第10天，各模型组与空白组比较，小鼠体重均显著降低;连续造模2周(14 d)后，限食劳倦组、限食放血组及综合造模组与空白对照组比较，小鼠体重均显著降低。3.3 对脏器系数的影响连续造模2周(14 d)后，称取各组小鼠的体重及各脏器的重量，按照脏器系数公式计算出各组小鼠的脏器系数比值。结果显示，限食劳倦组、限食放血组、综合造模组与空白组相比较，脏器系数显著降低。3.4 对血常规的影响连续造模2周(14 d)后，用全自动血球计数仪检测血中的白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、红细胞比容(HCT)及平均红细胞血红蛋白量(MCH)。结果显示，与空白组相比，限食劳倦放血组的白细胞数减少;劳倦放血组的白细胞数增多，红细胞比容增大，平均红细胞血红蛋白量降低。
4 讨论
4.1 对一般情况的影响外观变化可以清楚反映小鼠的进食、饮水、饲养等情况，通过造模阶段对小鼠的饲养以及造模结束后的放血实验，小鼠的外观发生了比较明显的变化，血具有濡养和化神两个方面的作用，从濡养方面来说，小鼠因劳倦、饮食不足及放血等因素造成了血虚的情况，所以血对于小鼠的耳廓、皮毛等均出现了影响，使得小鼠耳廓鼻唇颜色变浅，皮毛不光泽;从化神方面来说，小鼠因失血而造成了血虚的情况，从而出现了小鼠的精神萎靡、腰背团缩、动作灵敏度降低的情形。与空白组相比，其他四组在外观上均有不同程度的不良变化，尤以限食劳倦放血组不良变化最为明显，可见对其的处理在血虚造模时影响最大。
4.2 对体重的影响体重变化从特定角度可以直接体现体内气血充足与否。正常饲养状态下的小鼠体重会随着饲养时间的延长而逐渐增加。劳倦放血组不控制饮食，小鼠体重虽然也呈逐渐增加之趋势，但是增长幅度较正常饲养状态下的小鼠慢。而限食劳倦组、限食放血组、综合造模组各组体重均呈下降趋势，在劳倦或放血单因素影响下，小鼠体重下降比重比较小且劳倦与放血造成的体重下降比重相差无几。劳倦与放血双因素叠加时，体重下降比重最大。这也就是外伤加虚劳内损对机体气血造成较大耗伤。
4.3 对脏器系数的影响脏器系数是实验动物脏器质量与其体重的比值，亦称为脏体比。通常情况下，实验动物各脏器系数是相对恒定的数值，当实验动物发生损伤或病变时，受损脏器的脏体比会随之发生改变。不同脏器脏体比的改变预示小鼠不同脏器出现水肿、充血、增生或者萎缩。经过14 d的造模处理后，四组小鼠的肝脏系数和胸腺系数与空白组差异最大，而且为负值差异。肝脏，主藏血，脾脏，主运化，与血液等津液的化生有密切的关系。脾脏出现明显萎缩，小鼠不能得到充足的食物，脾胃运化无源，小鼠血液生化不足，加之肝脏不能藏血，血液输布障碍，造成小鼠血虚。
4.4 对血常规的影响血液中红细胞病理性增多多是由于严重呕吐、腹泻、大面积烧伤及肿瘤疾病，还包括心肺疾病及干细胞疾病。而减少多由于急性或慢性失血，红细胞被破坏，血管内外溶血，缺乏造血因素，造血障碍和造血组织损伤。白细胞病理性增多多由于急性化脓性感染、病毒感染、白血病、严重烧伤、大面积急性失血。而减少多由于某些感染病、再生障碍性贫血、自身免疫性疾病、脾功能亢进等。血常规中各指标数值与标准差别越大，证明小鼠血虚越严重。劳倦放血组中小鼠RBC、HCT两个指标均与空白组有明显差异，劳倦放血组小鼠血液中红细胞数量降低，红细胞是西医血常规中衡量贫血最重要的指标，也就是中医中的血虚，表明劳倦放血组小鼠血虚最为明显，综合造模组中WBC与空白组有明显差异。WBC数量减少，表明小鼠机体免疫能力降低，抵抗外邪入侵的能力下降。
综上所述，采用综合造模法制备血虚证小鼠模型，能显著降低小鼠体重、脏器系数及白细胞数，但对红细胞数无显著影响，可能与放血间隔时间及小鼠自身恢复能力有关，其中的原因和机制还有待进一步实验验证。