结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在我国恶性肿瘤发病率中位居第四。靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab)是目前研究最为广泛的肿瘤靶向抗体治疗药物之一，2004年被FDA批准用于转移性结直肠癌的治疗，虽有一定疗效，但单一的靶向治疗仍存在着局限性，部分使用西妥昔单抗治疗的患者在治疗一段时间后出现耐药，最终导致肿瘤的复发。目前发现 KRAS突变会导致肿瘤细胞对西妥昔单抗的原发性耐药，使用西妥昔单抗的指征被严格限定在 KRAS野生型的患者。约有 35% ～40% 结直肠癌患者存在KRAS突变，这部分 KRAS突变患者不能从单独西妥昔单抗治疗中获益。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)是由外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PB-MC)在体外经多种细胞因子及 CD3单抗诱导培养的一群异质性细胞群，包括 CD8+T、NK和 NKT细胞等。CIK作为抗肿瘤过继细胞免疫治疗的方案之一已在临床肿瘤治疗中被广泛应用，有研究报道 CIK在结直肠癌治疗中的临床疗效及安全性，但 CIK细胞不能长久地对肿瘤细胞进行抑制而疗效有限，CIK细胞与其他抗肿瘤治疗手段联合使用来促进抗肿瘤效应被越来越多的学者所关注。本课题组前期的研究中发现，NK细胞在联合西妥昔单抗后可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒(antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC)作用对 KRAS突变及野生型结直肠癌细胞发挥相同的杀伤效应。本研究通过观察 CIK细胞联合西妥昔单抗后对 KRAS突变及野生型结直肠癌细胞株的杀伤效应，探讨 CIK细胞联合靶向治疗抗体在结直肠治疗中的应用。
1 材料与方法
1.1 细胞株及抗体
人结肠癌细胞 DLD-1(colorectal adenocarcinoma cell line，KRASmutantG13D)及 Caco-2(colorectal adenocarcinoma cells line，KRASWT)细胞株均购自中国典型培养物保藏中心，由本实验室传代后液氮保存。用于细胞培养的 RPMI-1640培养基购自 Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、链 霉 素 及 Trypsin-EDTA(0.05%)均 购 自Gibco公司。西妥昔单抗(cetuximab，鼠/人嵌合抗EGFR抗体，IgG1)购于百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)公司。
1.2 方法
1.2.1 CIK细胞的体外扩增及鉴定 肝素抗凝管收集健康志愿者外周静脉血 30mL，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。将分离的 PBMC接种于T25细 胞 培 养 瓶 内，用 GT-T551无 血 清 培 养 基(Takara公司)调整细胞密度为 1109个/L。细胞培养瓶置于 37℃、5% CO2孵育箱中培养，第 1天加入 1000000IU/LIFN-(PeproTech公司)及1%的自体血浆，24h后加入 300000U/L白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2，北京四环生物公司)和50g/L抗 CD3单克隆抗体(RD公司)继续培养，每隔 3～4d补充新鲜培养基，调整细胞密度为1109个/L，同时补加 300000U/LIL-2，第 14～16天时开始收集细胞。
1.2.2 CIK细胞表型和 DLD-1、Caco-2细胞膜表面分子检测 通过流式细胞检测，按照 1106个/样本将 CIK、DLD-1及 Caco-2细胞加入流式管中，洗细胞 2次，震荡混匀后加入 Fc封闭抗体 anti-CD16/CD32封闭作用 30min。分别加入流式抗体FITC-鼠抗人 EGFR单抗(ebioscience)、FITC-鼠抗人 CD3单抗(BD)、PE-鼠抗人 CD56单抗(BD)、APC-鼠抗人 CD8单抗、APC-鼠抗人 CD16单抗或同型对照抗体，混匀后 4℃避光结合 30min，洗细胞 2次 去 除 未 结 合 的 抗 体，PBS重 悬 细 胞。BeckmanFC500型流式细胞仪检测，Flowjo10.0软件分析实验结果，满足 CD3+CD56+20%，CD3+CD8+60%的 CIK细胞用于后续实验。
1.2.3 培养液上清中的细胞因子水平检测 通过ELISA法，分别收集培养第 1天及第 14天的 CIK细胞培养上清液，分装后 -80℃保存备用。细胞因子检测：IFN-及 TGF-测定均采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书操作;以标准品 450nm处的吸光度(OD)值做标准曲线，计算待测样品中细胞因子的含量，每份样本设 3个复孔。
1.2.4 CIK细胞联合西妥昔单抗对人结直肠癌细胞的杀伤作用 通过实时无标记细胞分析仪(real time cellular analysis，RTCA，美国 ACEA公司)检测，向 RTCA检测板的检测孔分别加入 100L完全培养液，放入 RTCA中读取背景数据。取出 RT-CA检测板接种预先制备的细胞悬液，DLD-1及Caco-2细胞分别以 2104及 1.5104个/孔接种，设肿瘤细胞单独组、CIK-肿瘤细胞组及 CIK联合西妥昔单抗-肿瘤细胞组，每组细胞设置 3个复孔，将 RTCA检测板再次放回 RTCA，37℃ 5%CO2培养箱中孵育 24h后加入西妥昔单抗(1mg/L)50L，其余孔补加 50L完全培养基。抗体孵育1h后按照 20∶1效靶比加入 CIK细胞 50L。将RTCA检测板再次放回 RTCA仪，设置每隔 15min监测并记录细胞指数(cellindex，CI)值，连续监测45h，选择实验第 45h数据计算杀伤率。按照下列公式计算：细胞杀伤率% =(对照组 CI值 -实验组 CI值)/对照组 CI值 100%。
1.3 统计学处理
使用 Graph Pad Prism软件来进行数据统计学处理，数据采用均数 标准差(xs)表示，符合正态分布的计量资料比较采用 t检验，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Caco-2及 DLD-1细胞表面的 EGFR表达
本实验中所使用的 Caco-2及 DLD-1细胞表面EGFR均高表达，分别为 81.6%及 82.9%。见图 1。
2.2CIK细胞亚群
倒置显微镜下观察 CIK细胞生长情况，诱导前细胞体积较小，呈圆形散在分布，在诱导培养过程中细胞体积逐渐增大，培养第 5天细胞开始形成细胞集落，随着培养时间延长而集落增多，培养至第 14天时细胞体积明显增大，CIK细胞于培养基中悬浮成团分布，数量显著增多。见图 2。与培养前比较，CIK细胞经过 14d的体外活化扩增后 CIK细胞亚群中 CD8+T、CD3+CD56+NKT及 CD16+CD56+NK细胞比例均显著增高(P0.01或 P0.05)。见表 1。
2.3 CIK细胞培养基上清液中的 IFN-及 TGF-水平
ELISA结果显示，与培养第 1天比较，CIK细胞培养第 14天时，培养基的上清液中 IFN-水平由 34.835.4ng/L增高为 2041.8697.9ng/L(P 0.01)，而 TGF- 的 水 平 由 1 293.8633.9ng/L下降为 116.726.8ng/L(P0.01)。见图 3。
2.4 CIK细胞联合西妥昔单抗对 DLD-1及 Caco-2细胞的杀伤作用
将经过 14d体外扩增培养的 CIK细胞作为效应细胞，结合有抗 EGFR单抗西妥昔单抗的肿瘤细胞作为靶细胞，按照 20∶1的效靶比将效应细胞与靶细胞共培养，RTCA法检测 CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。图 4中显示 CIK细胞对 DLD-1及Caco-2细胞株的杀伤率分别为 16.04% 0.87%及 27.67% 3.10%，而当联合使用 1mg/L抗 EG-FR西妥昔单抗后杀伤率分别增高到 31.56% 3.55%及 35.96% 1.73%。
3 讨论
CIK细胞主要由其中的 CD3+CD56+NKT细胞通过非 MHC限制性的细胞毒作用来杀伤肿瘤细胞，此外，在本研究中还检测到在培养 14d时CIK细胞培养上清中 Th1型细胞因子 IFN-水平增高近 60倍，而可抑制抗肿瘤免疫应答的 TGF-水平降低了近 10倍，因而 CIK细胞还可通过释放的细胞因子改善肿瘤微环境促进 Th1型免疫应答而增强机体抗肿瘤效应。本研究中使用的 CIK细胞对 DLD-1及 Caco-2结直肠癌细胞株均可发挥杀伤效应，而在联合西妥昔单抗后杀伤效应进一步增强，对 KRAS突变型 DLD-1及 KRAS野生型 Ca-co-2肿瘤细胞均可发挥增强的杀伤效应。由西妥昔单抗介导的 ADCC作用是通过 NK细胞表面的CD16识别结合于肿瘤细胞上的抗体 Fc段，NK细胞活化而杀伤肿瘤细胞。有研究发现，CIK细胞联合抗 CD20单抗后所增强的细胞毒效应与 CIK细胞中含有的 NK细胞有关，由于 CIK细胞并不高表达所有的 FcRⅢ (CD16、CD32及 CD64)，且 在CIK细胞中去除 NK细胞后显著降低了联合抗体后所增强的细胞毒性，因而推测 CIK细胞对肿瘤细胞所发挥的细胞毒作用主要是由 CIK细胞中的NKT细胞发挥，而在联合抗体后所增强的细胞毒作用是由 CIK细胞中的 NK细胞所发挥，该结论与本研究中的发现一致，通过 14d的体外诱导培养，本课题中所使用的 CIK细胞中的 NK细胞数量较培养前有所增高(7.0% 6.6%)，因而也推测在本研究中联合西妥昔单抗后所增强的细胞毒作用是由 CIK中部分 NK细胞所发挥的 ADCC效应。
CIK细胞有着体外扩增能力强、安全性高、具有广谱的肿瘤杀伤能力及肿瘤趋化性等优势。而西妥昔单抗不仅可直接抑制肿瘤生长，还可活化NK细胞通过 ADCC效应而杀伤肿瘤细胞。因而，将 CIK细胞与西妥昔单抗联合用于结直肠癌的治疗具有以下优势，首先，体外活化扩增的CIK细胞将为结直肠癌的治疗提供大量的效应细胞而发挥抗肿瘤效应，在联合西妥昔单抗后 CIK细胞中的部分 NK细胞与西妥昔单抗的 Fc段结合将进一步通过 ADCC效应来促进抗肿瘤作用;其次，由于 KRAS突变不改变 EGFR胞外段构象，西妥昔单抗仍能与 EGFR结合，因而 CIK细胞联合西妥昔单抗可对 KRAS突变及野生型结直肠癌细胞均发挥杀伤效应，从而扩大了西妥昔单抗的应用适症。据此，CIK细胞与西妥昔单抗的联合应用有可能成为一种新型有效的抗肿瘤治疗方案用于临床应用中。虽然该联合策略在体外实验中效果显著，但由于体内抗肿瘤的作用机制复杂，任何一种抗肿瘤治疗手段在体内都可能会出现比体外实验中更为复杂甚至相去甚远的效应，因而，进行深入的体内实验研究以及制定合理的联合治疗方案将是研究联合抗肿瘤治疗策略的关键。