摘 要 将N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亚胺（AMN）通过酰胺化反应接枝到聚丙烯酸链上，利用生成的聚合物在水溶液中的自组装， 制备了一种水溶性荧光纳米粒子（PAAMN）。采用紫外可见光谱、核磁共振氢谱、透射电镜、动态光散射和荧光光谱方法对PAAMN进行了表征，MTT法检测其细胞相容性，最后用荧光显微镜观察其自身荧光及细胞成像效果。实验结果表明， PAAMN为球状结构，萘酰亚胺荧光团的摩尔取代度为4.1%； 在生理pHl件下，以390 nm为激发波长，PAAMN在534 nm处发射较强的荧光，且光稳定性较好； 在pH 4.0～10.0范围内，其荧光波长无明显变化，荧光强度随pH值增大而逐渐减小，但pH敏感程度小于AMN。PAAMN具有良好的细胞相容性，能进入细胞，且在～390 nm激发光下发射绿色荧光，可用于细胞成像。
关键词 荧光纳米粒子； 聚丙烯酸； 萘酰亚胺； 自组装； 细胞成像
1 引 言
荧光纳米粒子是一类重要的纳米功能材料，在细胞成像、疾病诊断及生物传感等领域有广阔的发展前景[1，2]，而具有良好水溶性、光稳定性及低毒性是其在这些领域中应用的前提。目前，基于无机材料的荧光纳米粒子研究较为广泛，如无机半导体量子点[3]、碳量子点[4]和金纳米粒子[5]等，这些纳米粒子常需要通过表面修饰或者聚合物包覆来提高其水溶性、可修饰性、生物相容性等特性。相对于无机荧光纳米粒子，有机聚合物荧光纳米粒子在结构多样性和功能可设计性方面具有明显优势，近年来引起了研究者的兴趣[6～10]。聚合物纳米粒子中荧光团的存在形式主要有两种[11，12]： 一种是非共价结合，如在纳米粒子制备过程中或者制备完成后，通过包埋或吸附方法负载荧光团； 另外一种是共价键合，如通过表面修饰方式将荧光团键合到无荧光的纳米粒子上，或先制备荧光聚合物单体，再聚合形成纳米粒子。利用生物相容性两亲聚合物的自组装对荧光团进行包裹是制备荧光聚合物纳米粒子的常用方法[11，13，14]，该方法简单，得到的纳米粒子水分散性及生物相容性良好，但由于荧光团以非共价方式结合，在使用过程中容易泄露。采用先将荧光团与聚合物共价结合再进行自组装的方法可以减少或避免染料泄露问题，有效提高荧光纳米粒子的稳定性，目前该类水溶性荧光纳米粒子的研究报道较少[15～17]。
聚丙烯酸（PAA）是一种常用高分子材料，在化工、纺织、水处理、食品、医药等领域应用广泛[18，19]。由于PAA无毒、易溶于水，且富含可功能化的羧基，近年来被研究者用于无机纳米粒子的修饰制备有机无机复合纳米材料[20，21]、与共价聚合物进行自组装制备水溶性荧光纳米粒子[22]、作为两亲聚合物的亲水链段制备纳米胶束[23]、进行交联制备纳米凝胶[24]等研究。本研究采用1，8萘酰亚胺荧光化合物N氨基4N甲基哌嗪1，8萘酰亚胺（AMN）对PAA进行接枝改性，制备了两亲性的荧光聚合物，并利用该聚合物在水溶液中的自组装得到了一种新的荧光纳米粒子（PAAMN）； 对其形态、结构及荧光特性进行了表征，并考察了其细胞毒性及细胞成像能力。结果表明，此纳米粒子具有好的水溶性、光稳定性和细胞相容性，可进入细胞并发射绿色荧光，在细胞成像方面有良好应用前景。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Bruker AV400型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）； UV2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）； 320S型pH计（梅特勒托利多仪器有限公司）； F4600型荧光分光光度计（日本日立高新技术公司）； JEM100CXII型透射电镜TEM（日本电子株式会社）； IX51型倒置荧光显微镜（奥林巴斯株式会社）； ST360型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）； Zetasizer Nano ZEN3600型动态光散射纳米激光粒度仪（英国Malvern公司）。
AMN的合成见文献[25]； 聚丙烯酸（PAA， 分子量2.6万，河南凯特化工有限公司）； Gibco胎牛血清及DMEM培养基（Invitrogen公司）； 3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐（MTT，Sigma公司）； HeLa细胞为实验室传代培养； 其它试剂均为市售分析纯； 实验用水为去离子水。
2.2 PAAMN的制备
将0.5 g PAA，0.63 g EDAC・HCl和0.79 g NHS溶于10 mL DMF中，在室温下搅拌反应1 h，向其中加入含AMN的DMF溶液，并于60℃搅拌反应4 h。将反应液离心，上清液放入透析袋中，在pH 3～4的稀HCl中进行透析。透析一段时间后将袋内胶状固体取出，溶解在pH 11的NaOH溶液中，滴加稀HCl使其析出。经过多次碱溶酸沉处理后，将该固体溶解，再于水中透析，测试透析液荧光强度。当透析液荧光强度为零时，将透析袋内溶液取出， 冻干， 得目标产物（PAAMN）。
2.3 PAAMN的形态及结构表征
将纳米粒子溶液滴在含有Formar膜的铜网上，并进行负染，采用TEM观察其形态； 采用纳米激光粒度仪测定PAAMN在水溶液中的粒径； 用DMSOd6+D2O为溶剂测定PAAMN的1H NMR光谱。
将AMN溶于乙醇中，配成1.0 mg/mL储备液，再用水稀释得所需浓度的工作溶液。将PAAMN用水溶解， 配制成2.0 mg/mL储备溶液，并用水稀释至所需浓度的工作溶液。分别测定AMN及PAAMN工作溶液的紫外可见吸收光谱； 在392 nm下测定不同浓度AMN溶液的吸光度并绘制标准曲线。根据PAAMN溶液在392 nm处的吸光度和AMN的标准曲线，按文献[25]的方法计算纳米粒子中荧光团的摩尔取代度。
2.4 荧光性质研究
荧光光谱及量子产率测定： 测定水溶液中PAAMN及AMN的荧光光谱； 以硫酸奎宁为参比，测定水溶液中PAAMN及AMN的荧光量子产率，硫酸奎宁在0.05 mol/L H2SO4溶液中的量子产率按0.55计算[26]。 光稳定性考察： 以390 nm为激发波长，534 nm为发射波长，每隔5 s测定一次PAAMN溶液的荧光，观察2.5 h内荧光强度的变化。
金属离子对PAAMN荧光的影响： 分别移取PAAMN的工作溶液0.1 mL和Ph 7.4的磷酸盐缓冲溶液5.0 mL加入到10.0 mL比色管中，再加入金属离子； 以不加金属离子的PAAMN体系作为对照。各溶液用水定容后测定荧光光谱，记录荧光强度。
pH值对PAAMN荧光的影响： 分别移取PAAMN及AMN的工作溶液0.1 mL加入到10.0 mL比色管中，用不同pH值的磷酸盐缓冲溶液定容后测定荧光光谱，记录荧光强度。
2.5 MTT法检测细胞相容性
将对数生长期的HeLa细胞按每孔5000个细胞接种于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM为培养基，在37℃含5%CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁后，吸去板内培养基残液，加入含不同浓度PAAMN 的培养液， 置于培养箱中孵育24 h，此后向每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续孵育4 h。然后移去板内液体，每孔加入200 μL DMSO，将细胞培养板放置摇床上， 低速振荡使结晶物充分溶解。 用酶标仪在490 nm波长处测量各孔的吸光度（A）。以未加PAAMN的细胞作空白对照，计算细胞的相对增殖率（Relative growth rate，RGR）： RGR = （A实验组/A空白对照组）×100%。
2.6 纳米粒子及染色细胞的荧光显微成像
纳米粒子的荧光观察： 将0.1 mg/mL PAAMN溶液用PBS溶液（pH7.4）稀释10倍，然后取0.1 mL置于24孔培养板中，于荧光显微镜下观察。
细胞染色及成像： 将HeLa细胞接种于24孔培养板中，待细胞贴壁后，移去原培养基，加入含0.01 mg/mL PAAMN的新培养基，并置于CO2培养箱中于37℃下培养2 h。然后移除培养基，用PBS溶液将细胞洗涤3次，再加入4%的多聚甲醛固定细胞，最后用荧光显微镜观察细胞成像效果。
3 结果与讨论
3.1 PAAMN的制备与表征
PAAMN 的制备方法如图1所示。PAA中的羧基被活化后与AMN中的氨基反应，形成接枝聚合物； 该聚合物在透析过程中发生自组装形成纳米粒子，未反应的荧光团和溶剂也在透析中除去。将透析纯化后的纳米粒子溶液冻干，得到PAAMN。固体PAAMN能溶解于水中形成黄色透明溶液。
采用TEM、动态光散射（DLS）、UVVis 及1H NMR方法对纳米粒子的形态及结构进行了表征。TEMD如图2A所示， 纳米粒子呈规则球状颗粒； 如图2B所示，DLS测定PAAMN的水合粒径约为290 nm。
图3为AMN和PAAMN的UVVis光谱， AMN的最大吸收峰在392 nm，PAAMN的最大吸收峰在394 nm。1H NMR测定表明，PAAMN在7.00～8.77 ppm处有明显的芳环氢相关信号，且在2.5～3.0 ppm处有哌嗪环上亚甲基的相关信号（图4）。由于PAA在300 nm以上无明显的吸收峰，其结构中不存在芳环，而纳米粒子中未与PAA键合的荧光团已通过透析除去，因此上述结果证明萘酰亚胺荧光团已经被固定于PAAMN中。经计算，荧光团的摩尔取代度为4.1%，说明PAA中仅有部分羧基被取代，生成的纳米粒子中仍有大量可修饰的羧基存在，为其进一步功能化提供了条件。
3.2 荧光性质
由AMN和PAAMN的荧光激发和发射光谱（图5）可见，PAAMN具有与AMN类似的特征荧光光谱，它们的最大激发和发射波长均分别为390和534 nm，说明PAAMN的荧光是由萘酰亚胺荧光团产生，且与PAA链键合对荧光团的荧光波长无明显影响。水溶液中PAAMN和AMN的量子产率测定结果分别是0.14和0.08，说明形成纳米粒子增强了萘酰亚胺荧光团的荧光。在设定的测试条件下，2.5 h内测定PAAMN的荧光强度变化在7%以内（图6），说明其有较好的光稳定性。
金属离子对PAAMN荧光强度影响的实验结果表明，在生理pH条件下，1.0106 mol/L的Mg2+，Hg2+，Ni2+，Mn2+，Al3+，Zn2+，Ba2+，Ag+和Cd2+对PAAMN的荧光没有明显影响ex=390 nm； em=534 nm.
由于许多4氨基萘酰亚胺衍生物对pH敏感[27，28]，因此本研究进一步考察了pH值对PAAMN荧光性质的影响。 结果表明，在pH 4.0～10.0范围内，PAAMN的最大激发和发射波长不随pH值变化而变化，但荧光强度随着pH值增大而逐渐减小。如图7所示，PAAMN的这种pH调控荧光分子开关功能与AMN类似，但荧光强度变化趋势及范围要小于AMN。造成上述现象的原因可能是[28，29]： 碱性条件下，萘酰亚胺类化合物哌嗪基团中的烷基胺作为电子给体，向萘酰亚胺进行光致电子转移（PET），从而淬灭萘酰亚胺的荧光； 酸性增加使哌嗪基上的氮原子发生质子化，抑制了PET过程，因此荧光强度增强； 与AMN相比，PAAMN中有较多的羧基，对哌嗪上氮原子的质子化具有一定的缓冲作用，因此其荧光强度随pH值变化相对较小。
3.3 细胞相容性
用于生物样品的纳米材料应具有良好的生物相容性。细胞毒性试验是体外评价纳米材料生物相容性的常用方法，具有经济、快速、操作方便等优势。本实验采用MTT法考察了PAAMN浓度（0.001～0.25 mg/mL）对HeLa细胞增殖的影响，并根据美国药典中RGR与细胞毒性分级的关系（RGR≥100%为0级； 80%～99%为Ⅰ级； 50%～79%为Ⅱ级； 30%～49%为Ⅲ级； 0～29%，Ⅳ级）对其毒性进行评级。从图8可见，在测定的浓度范围内，当PAAMN浓度低于0.1 mg/mL时，细胞的RGR均大于90%； 随着PAAMN浓度增加，RGR略有下降，但都大于80%。各测试浓度PAAMN对HeLa细胞的毒性反应分级均为Ⅰ级，说明PAAMN具有良好的细胞相容性。 3.4 荧光成像
PAAMN溶液的荧光显微成像如图9A所示，在390 nm激发光下，PAAMN能发射绿色的荧光。由于PAAMN具有好的细胞相容性，且在生理条件下具有较强的荧光，因此进一步考察了其用于细胞成像的可行性。
HeLa细胞在含0.01 mg/mL PAAMN的培养基中孵育，然后洗去多余的纳米粒子，将细胞固定， 在390 nm激发光下观察成像效果，结果如图9B所示，染色后的细胞仍具有较好的形态， 发出绿色荧光，表明PAAMN在细胞成像方面具有应用潜力。
4 结 论
本研究以具有良好生物相容性及水溶性的PAA聚合物为基础， 进行萘酰亚胺衍生物接枝改性，并将生成产物自组装制备了球形的纳米粒子。该纳米粒子具有好的水溶性，荧光团以共价键的方式固定于其中，不易泄漏， 其在生理条件下具有较强的荧光＼，较长的荧光发射波长（>500 nm）＼，大的Stocks位移（144 nm）以及良好的光稳定性和细胞相容性。荧光显微成像表明，合成的荧光纳米粒子能进入细胞，且在390 nm激发光下发射绿色荧光，可用于细胞荧光成像。由于具有大量可用于修饰的羧基，对其进行结构修饰还有望制成高灵敏度和选择性的荧光探针，在样品检测及生物成像研究中有应用潜力。
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