摘要 [目的]建立兽药三黄散超微粉中黄芩苷和盐酸小檗碱含量的高效液相色谱法测定方法。[方法]采用十八烷基硅烷键合硅胶柱ZORBAX Eclipse XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，黄芩苷和盐酸小檗碱的检测波长分别为278 nm和347 nm，流动相：乙腈-2 mL/L磷酸水溶液（体积比25∶75），柱温30 ℃；流速1.0mL/min，进样量10 μL。[结果]黄芩苷、盐酸小檗碱进样量分别在0.1180～1.1800、0.051 6～0.516 0 μg（R2=0.999，n=6）范围内与其各自峰面积积分值呈良好的线性关系，平均加样回收率分别为101.696%、100.604%（n=6）。[结论]此方法精确、快速，重现性和精密度良好，可为兽药三黄散超微粉的质量控制及质量标准的建立提供技术支撑。
关键词 三黄散超微粉；黄芩苷；盐酸小檗碱；高效液相色谱法
中图分类号 S853.74 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）18-0266-02
兽药三黄散超微粉主要由黄柏、黄芩、大黄等组成，主治细菌性败血症、烂鳃、肠炎和赤皮，适用于各类水产养殖动物[1]。黄芩苷（baicalin）和盐酸小檗碱（berberine hydrochloride）是主要有效成分，黄芩苷是一种黄酮类化合物，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用，在清除氧自由基、减轻组织的缺血、促进细胞凋亡等多方面均有作用[2-3]。盐酸小檗碱是一种异喹啉生物碱，又称黄连素（umbellatine），对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌等有抑制作用，主要用于胃肠道感染及菌痢等[4-5]。显然，黄芩苷、盐酸小檗碱含量高低直接影响三黄散超微粉的药效。
超微粉碎技术可将中药材粉碎到粒径1～75 μm，是近年来中药加工的一项新技术，该技术改善了中药的品质，提高了中药的生物利用度，推动了中药的标准化，是中药现代化的重要途径之一。
本试验采用双波长高效液相色谱法测定三黄散超微粉中黄芩苷、盐酸小檗碱的含量，结果表明：该方法重现性和精密度均良好，适用于三黄散超微粉中黄芩苷、小檗碱的含量测定。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
色谱仪：安捷伦1260高效液相色谱仪；色谱柱：ZORBAX Eclipse XB-C18键合硅胶柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），美国安捷伦公司生产；KH2200DE型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司：FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
黄芩苷：成都普思生物科技有限公司，批号DS10121401；盐酸小檗碱：中国食品药品检定研究所，批号110713-201212；无水甲醇：分析纯，济宁佰一化工有限公司；乙腈：色谱纯，sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；磷酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；三黄散超微粉：四川金科药业有限责任公司，250 g/袋，批号：20150325、20150618、20150517。 1.2 色谱条件[6-7]
色谱柱为ZORBAX Eclipse XB-C18键合硅胶柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温30 ℃；黄芩苷和盐酸小檗碱的检测波长分别为278 、347 nm，流动相为乙腈―2 mL/L磷酸水溶液（25∶75）；流速为1.0 mL/min。
1.3 溶液的配制
1.3.1 标准品溶液。分别称取黄芩苷标准品、盐酸小檗碱23.6、17.2 mg，分别置于50 mL棕色容量瓶中，分别加甲醇溶解，定容，得标准品储备液。分别量取黄芩苷标准品储备液、盐酸小檗碱标准品储备液25、15 mL，置于100 mL棕色容量瓶中混合，加甲醇定容，用孔径为0.45 μm的微孔过滤膜滤过，即得浓度分别为0.118 0、0.051 6 mg/mL的黄芩苷、盐酸小檗碱标准品混合溶液。
1.3.2 供试品溶液 。取三黄散超微制剂（批号：20150325）约100 g，混合均匀，精密称取0.5 g，置于25 mL锥形瓶中，加入甲醇25 mL，静置1 h后超声波处理1 h，静置至室温后用甲醇补足损失的质量，过滤，将滤液用0.45 μm的微孔过滤膜过滤，即得。
1.3.3 阴性对照溶液。按三黄散超微粉的处方和制备工艺[1]，按1.3.2的方法制备不含黄芩、黄柏的阴性对照溶液。
1.4 系统适用性试验
分别量取上述标准品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按1.2色谱条件检测，计算色谱柱的理论塔板数、分离度、拖尾因子[8-9]。
1.5 方法学考察
1.5.1 线性关系考察 。精密量取1.3.1中的标准品混合溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，摇匀，即得梯度标准品混合溶液。取上述标准品混合溶液各10 μL，按1.2中色谱条件测定，以峰面积积分值y为纵坐标，标准品浓度x为横坐标，绘制标准曲线。
1.5.2 稳定性试验。分别量取1.3.2中的供试品溶液，在室温下，于第0、2、4、6、8、12小时进样量10 μL，按1.2中色谱条件测定，计算黄芩苷、盐酸小檗碱的平均峰面积积分值和RSD。
1.5.3 精密度试验。精密量取1.3.1中标准品混合溶液10 μL，按1.2中色谱条件重复测定6次，计算二者的平均峰面积积分值和RSD。
1.5.4 重复性试验。取同批号为20150325的样品共6份，按1.3.2方法制备供试品溶液，进样量10 μL，按1.2中色谱条件进行测定，计算二者的含量和RSD。
1.5.5 加样回收试验[10]。称取已知含量的样品（批号：20150325，黄芩苷和盐酸小檗碱的平均含量分别为11.63、19.85 mg/g）6份，每份约0.05 g，置锥形瓶中，分别精密加入1.3.1中标准品溶液5 mL，另精密移取甲醇溶液20 mL，加入上述锥形瓶中，按1.3.2中方法制备供试品溶液，按1.2中色谱条件测定样品含量，计算加样回收率。
1.6 样品含量的测定
分别取3批样品，按1.3.2方法制备供试品溶液，按照1.2中色谱条件测定含量。
2 结果与分析
2.1 系统适用性试验
由图1～4可知，供试品与标准品混合溶液中黄芩苷、盐酸小檗碱的特征峰保留时间相同，二者的色谱峰与其相邻未知色谱峰的分离度良好。阴性对照色谱图（图5～6）中未出现杂质峰，表明本法专属性强，阴性对照溶液对测定无干扰。
2.2 方法学考察
2.2.1 线性关系。检测结果表明，黄芩苷、盐酸小檗碱的回归方程分别为y=2 9 952x-10.54（R2=0.999，n=6）、y=21 863x+8.279（R2=0.999，n=6），黄芩苷、盐酸小檗碱进样量分别在0.118 0～1.180 0、0.051 6～0.516 0 μg范围内线性关系良好。
2.2.2 稳定性试验。黄芩苷、盐酸小檗碱的平均峰面积积分（下转第269页）
值分别为1 366.7、1 886.2，RSD分别为0.51%、0.19%，表明供试品溶液在室温下放置12 h内稳定（n=6）。
2.2.3 精密度试验。标准品溶液中黄芩苷、盐酸小檗碱的平均峰面积积分值分别为3 106.7、1 287.3，RSD分别为0.39%、0.29%，表明仪器精密度良好（n=6）。
2.2.4 重复性试验。样品中黄芩苷、盐酸小檗碱的平均含量分别为11.63、19.85 mg/g，RSD分别为0.83%、1.14%，表明方法重复性良好（n=6）。
2.2.5 加样回收率试验 。由表1、2可知，黄芩苷、盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为101.696%、100.604%，RSD分别为1.655%、1.213%。这表明本方法回收率高，分离效果好。
2.3 样品含量的测定
经测定，批号20150325、20150517、20150618样品中黄芩苷含量分别为11.630 0、11.744 7、11.669 1 mg/g，盐酸小檗碱含量分别为19.850 0、20.212 5、19.880 8 mg/g。
3 结论与讨论
本试验中，流动相的选择是关键。本试验参考《中华人民共和国药典》2010版（一部）[11]，比较了不同流动相的分离效果，发现乙腈和2 mL/L磷酸水溶液为流动相分离效果最好。并且乙腈―2 mL/L磷酸水溶液体积比为25∶75时，黄芩苷和盐酸小檗碱的峰形良好，与其他干扰峰分离度均大于1.5。
试验结果表明，该方法可准确地进行定性、定量检测，能排除其他成分干扰，重复性好，可用于三黄散超微粉的质量控制。
4 参考文献
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