光化学对腺病毒病患的影响 光化学对腺病毒病患的影响 光化学对腺病毒病患的影响 精品源自高考试题 荧光显微镜观察结果。空白对照组和TPPS2a+90s光照组无eGFP表达。
Ad组、Ad+90s光照组及TPPS2a+Ad+90s光照组均有eGFP表达。Ad组和Ad+90s光照组eGFP表达量基本相当,但TPPS2a+Ad+90s光照组与Ad组和Ad+90s光照组相比eGFP表达量明显增多(图略)流式细胞检测结果。
空白对照组和TPPS2a+90s光照组eGFP表达率约为0,Ad组、Ad+90s和TPPS2a+Ad+90s光照组eGFP表达率分别为(4.9±0.
3)%、(5.2±0.
2)%和(19.9±0.
4)%(图略)。当Ad滴度分别为(MOI=
5、
50、
100)时,光照0、
30、
60、
90、120s后Ad转染效率经单因素方差分析结果显示,差异有统计学意义(F=308.89,263.93,101.70,P均<0.0
1)。组间两两比较结果显示,
60、
90、120s光照组与对照组相比,eGFP表达率明显增加;30s光照组与对照组相比,eGFP表达率差异无统计学意义;120s光照组与90s光照组相比,eGFP表达率差异无统计学意义。当光照时间一定时(0、
30、
60、
90、120s),MOI=
5、
50、100实验组Ad转染效率组间两两比较结果具有差异性(F=87.46,308.81,280.73,P均<0.01,)。在相同滴度和相同光照时间作用下(包括无光照组),Hep-2细胞eGFP表达率皆低于Hela细胞(图略)。
Westernblot检测CAR蛋白含量结果。Hep-2细胞CAR表达明显低于Hela细胞,差异具有统计学意义(t=-9.01,P<0.05,图略)。
基因治疗主要是通过载体系统(如质粒、病毒)将目的基因转入靶细胞内,目的基因在靶细胞内有效表达目的蛋白,继而产生一系列的细胞内生化反应,影响靶细胞的生理功能。然而载体系统对目的基因的低转导和目的基因在肿瘤细胞内低表达以及靶向性差等问题是限制基因治疗发展的主要问题。
Ad作为基因治疗中常用的载体已经应用到喉癌治疗的研究当中[4]。然而临床研究发现,要想达到预期治疗效果则需要大剂量的病毒颗粒,而不可忽视的是随之带来的全身免疫反应[5]。
于是,Ad治疗联合放射治疗[6]、免疫治疗[7]和光化学治疗[8]等治疗方法有望成为提高临床疗效的新途径。Ad-hTERT-eGFP是以内吞方式进入细胞,病毒颗粒能否从内吞囊泡高效释放出来,是决定转染效率高低的关键一环。
PCI的作用过程是:首先,光敏剂和Ad与组织细胞共同孵育,使二者能广泛分布于内吞囊泡;其次,组织细胞暴露在特定波长光照下,并诱发光化学反应。最终,光化学反应导致内吞囊泡膜破裂,囊泡内病毒颗粒释放到细胞质中。
研究发现PCI可以增加Ad转导率最高可达30倍[9]。本研究将PCI技术同Ad-hTERT-eGFP转染技术结合起来,具有以下优点:①增加Ad的转染效率和转染范围;②减少病毒上清使用量,减弱或消除机体对病毒的免疫反应;③光敏剂在病变组织的高度聚集性以及对照射的高反应性可以增加基因转染的靶向性。
本课题组前期通过脂质体介导HSV-tk基因对Hep-2细胞进行转染,联合应用更昔洛韦观察到HSV-tk/GCV系统对喉癌的细胞毒性作用呈现剂量依赖性,但存在基因转染效率不高的缺陷[10]。Engesaeter等[9]证实PCI联合Ad载体转染人宫颈癌Hela细胞等不同细胞系,皆发现不同程度转染效率的提高。
本实验首先对Ad、光敏剂和光照等因素对转染效率的影响进行了研究,倒置荧光显微镜和流式细胞分析结果表明:单独给予光敏剂或者光照处理,并不会影响其转染效率;光敏剂和光照共同作用于细胞诱发PCI可使Ad(MOI=
5)转染效率提高4倍。对Hep-2细胞和Hela细胞分别给予不同病毒滴度和不同光照时间流式细胞分析结果表明:30s光照时间不足以引发Ad转染效率的改变,而60s以上的光照可以引发Ad转染效率显着的升高,若光照时间大于90s,Ad的转染效率不再显着升高。
MOI=100时,无光照时转染率17.4%与90s光照转染率34.8%相比,升高约2倍;而MOI=5时,无光照时转染率5.3%与90s光照转染率19.9%相比,升高约4倍。表明PCI对低病毒滴度转染效率的提高作用更明显。
此外,实验结果还证实了随着Ad滴度的升高,Ad的转染效率也随之升高。相同感染复数和光照时间作用下,Ad对Hela细胞的转染效率总是高于Hep-2细胞。
Kasman等[11]研究发现Ad对膀胱癌细胞的转染效率很低与细胞表面CAR受体表达过低相关。本实验Westernblot结果显示Hep-2细胞CAR表达显着低于Hela细胞,表明CAR作为Ad感染细胞的受体,在Ad转染过程中可能起到重要作用。
本实验证实PCI可以增加Ad感染Hep-2细胞的转染率,尤其是低感染复数Ad的转染效率。并探讨了转染效率过低的原因,为后续Ad转染自杀基因杀伤喉癌细胞实验研究奠定基础。