目的：检测喉鳞状细胞癌患者外周血Treg细胞和Thl7细胞比例，研究其变化与意义。方法：采用流式细胞技术检测10例健康对照者和42例喉鳞状细胞癌患者外周血Treg和Thl7细胞比例，并观察Th17/Treg在喉癌分期中的变化。结果：与健康对照组比较，喉癌患者外周血Treg细胞和Th17细胞比例明显升高（P〈0.05）；发生淋巴结转移者较无淋巴结转移者的Treg和Th17细胞比例增高（P〈0.05）；通过分析不同喉癌分期中Th17/Treg细胞的分布，结果发现Ⅲ+Ⅳ期组Th17细胞的比例和Ⅰ+Ⅱ期无明显差异，而Treg细胞在Ⅲ+Ⅳ期比Ⅰ+Ⅱ期明显增高（P〈0.05）。结论：喉癌外周血中Th17和Treg细胞数量增多，二者比例增高，并随着疾病的进展而增加，表明二者均参与了喉癌的发生发展过程。
【关键词】喉鳞状细胞癌；Thl7细胞；Treg细胞；表达
【中图分类号】R730.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）08-0086-02
Abstract：Objective To investigate Th17 /T regulatory （ Treg） cell ratio in laryngeal cancer.Methods The two T cell subsets were determined in the peripheral blood of 42 patients with laryngeal squamous cell carcinoma（ LSCC） and 10 healthy volunteers by flow cytometry.Results Compared with the healthy controls，patients had a significantly higher proportion of both Th17 and Treg cells.Higher frequencies of Treg and Th17 cells were found in patients with lymph node involvement.Moreover，The results showed that there was no significant difference in the proportion of Th17 cells and the early stage of cells， while the Treg cells were significantly higher than those in group III and IV.Conclusion Our results suggested a counter regulation of Th17and Treg cells maybe involved in the development and progression of LSCC.
Keywords：Laryngeal Squamous Cell Carcinoma； Th17cell； Treg Cell； Expression
喉癌是发病率仅次于鼻咽癌的头颈部恶性肿瘤。目前采用手术、放化疗后生存率有显著提高，但是部分患者仍有局部复发和转移。免疫逃逸是肿瘤发生、发展和复发的主要原因，也是体内多种免疫细胞相互作用的结果。其中Thl7细胞及Treg细胞是近年来最受关注的CD4+T细胞亚群，在调节免疫功能中起重要作用，它们在肿瘤形成、发展中的作用和相互关系引起了相关学者的极大兴趣。本研究通过检测不同分期喉癌患者外周血中Th17及 Treg细胞水平的变化，探讨二者表达与喉癌发生、发展及变化的关系，为开发新的免疫治疗方法提供初步实验依据。
1资料与方法
1.1一般资料研究对象为2013年1月至12月在南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科收治的、未经任何治疗的男性喉鳞状细胞癌患者42例，年龄41～75岁，平均年龄（54.2±16.4）岁。根据2002年UICC关于喉癌的分期标准，（Ⅰ+Ⅱ）期18例，（Ⅲ+Ⅳ）期24例，其中颈淋巴结转移12例。另外以10例健康体检者作为对照组。受检者在清晨空腹采取静脉血2.0ml，肝素钠抗凝，2000r/min离心10min分离出血清后于-20℃冻存。采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用于RNA提取和流式细胞术检测。
1.2主要试剂APC标记的抗人CD4抗体、PE标记的抗人CD25抗体、FITC标记的抗人IL-17、Foxp3抗体（eBioscience公司）、Th17破膜剂（BF公司）、Foxp3检测专用固定剂和破膜剂（eBioscience公司）、RPMI1640培养基（Hyclone公司）、新生小牛血清（杭州四季青公司）、淋巴细胞分离液（上海朗顿生物科技有限公司）、佛波酯、离子霉素、莫能霉素（Sigma公司）。流式细胞分析仪（BD公司）、BIORAD model 550型酶标仪（伯乐公司）。
1.3实验方法Th17细胞检测：调整单个核细胞悬液浓度至1×106ml-1，分别加入50ng/ml（终浓度）佛波酯、1μg/ml离子霉素、1μg/ml BFA及含10%新生小牛血清的1640培养液。37℃、5%CO2培养箱培养6h后收集培养的细胞，1%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤、离心5min后弃上清液，加入APC标记的抗人CD4抗体2μl、破膜剂及FITC标记的抗人IL-17抗体，孵育30min后，PBS洗涤后再重悬细胞，转至流式细胞仪专用管内避光检测Th17细胞占CD4+T细胞的比例。
Treg细胞检测：调整单个核细胞悬液浓度至1×106ml-1，取100μl细胞悬液，加入10μl FITC标记的CD4抗体对细胞染色，4℃避光孵育30min，PBS洗涤细胞、然后加入Foxp3检测专用固定剂和破膜剂孵育洗涤细胞，加入10μl Foxp3单抗，室温下避光孵育20min，洗涤重悬细胞，上流式细胞仪进行检测，以CD4和CD25设门，分析门内Foxp3细胞亚群比例。 1.4统计学方法应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较用方差分析，P〈0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1喉癌组与健康对照组外周血Th17和Treg细胞百分率比较流式细胞术检测结果显示喉癌患者组Th17和Treg细胞百分率均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0.05），见表1；Ⅰ+Ⅱ期组中Th17细胞百分率与Ⅲ+Ⅳ期组比较差异无统计学意义（P>0.05），而Ⅰ+Ⅱ期组中Treg细胞百分率与Ⅲ+Ⅳ期组比较差异有统计学意义（P〈0.05），见表2；其中无淋巴结转移者外周血Th17和Treg细胞百分率均明显低于淋巴结转移组，差异有统计学意义（P〈0.05）。见表3 。
3讨论
免疫逃逸是恶性肿瘤发生、发展、浸润以及复发的重要原因，肿瘤细胞通过修饰自身表面抗原及改变组织微环境等途径来逃避自身免疫系统的识别及攻击，表现为肿瘤局部及外周血中免疫细胞及相关细胞因子之间的平衡被打乱。Th17和Treg细胞是CD4+T细胞重要的细胞亚群，在正常机体内Th17和Treg细胞保持一定的比例，其比例失调就会引起免疫功能低下或免疫耐受，从而导致肿瘤发生、发展，使肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的攻击[1]。Th17细胞通过分泌IL-17在介导细胞外病原体感染、肿瘤、哮喘、移植排斥反应、自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要作用[2]。有研究发现在肿瘤组织中Th17高表达者预后较差、病死率较高、生存期缩短。Foxp3是控制Treg细胞发育、分化及发挥免疫抑制功能的关键细胞因子，既对Treg细胞发挥效应起到“开关”的作用。Treg细胞及其细胞因子参与抑制抗肿瘤免疫，诱导肿瘤局部免疫耐受，通过分泌抑制性细胞因子抑制机体免疫反应。研究发现Treg细胞在外周血中也同样升高，且数量与肿瘤的进展程度和预后呈负相关[3-5]。
目前，对Th17与Treg细胞在炎症和自身免疫性疾病中存在失衡现象的研究较多，而在肿瘤中的研究则较少。Kryczek[6]发现随着肿瘤的进展，Th17和Treg细胞数量均增加，而Treg细胞增加的幅度高于Th17细胞；Li等[7]报道IL-17、Foxp3在肺癌和癌旁组织的表达水平均随肿瘤分期而上升，提示IL-17、Foxp3可能共同参与促进肿瘤进展；另外的研究也发现肺癌患者外周血中Treg细胞、Treg /Th17比值均高于健康对照组，且晚期患者更明显[8-9]。
本研究表明，喉癌患者外周血中Th17、Treg细胞水平均较对照组明显升高，Ⅲ+Ⅳ组高于Ⅰ+Ⅱ组，肿瘤分期越晚，Treg比Th17细胞增多更为明显。该结果提示，喉癌患者外周血中Th17和Treg细胞水平升高，且与肿瘤分期相关。而Th17细胞在Ⅲ+Ⅳ组中的比例与Ⅰ+Ⅱ组比较无提高，可能是晚期肿瘤通过局部浸润和血管转移，致被招募到肿瘤内的Th17细胞又释放至外周血中，出现晚期患者外周血中IL-17细胞比例比早期患者和健康者增高的现象。该淋巴细胞循环方式导致了外周血IL-17在不同临床分期患者中的所占比例有所不同。淋巴结转移组中Th17和 Treg细胞比例也较无淋巴结转移组升高，表明增多的Treg细胞可能通过介导免疫耐受，一定程度上促进恶性肿瘤的进展。动物研究结果也证实受肿瘤浸润的淋巴结及外周血的效应T细胞免疫应答，被肿瘤特异性Treg细胞的抑制，导致Treg细胞在局部占优势促进肿瘤的进展，提示Th17/Treg细胞分化失衡可能参与喉癌的转移过程[10]。
综上所述，喉癌外周血中Th17和Treg细胞数量增多，参与了喉癌的发生发展过程，但Th17和Treg细胞在肿瘤微环境内的变化失衡的具体机制及其对临床干预策略的意义，还有待进一步深入研究。
参考文献
[1]Bettelli E， Carrier Y， Gao W，et al.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441（7090）：235-238.
[2]Wakita D，Sumida K，Iwakura Y，et al. Tumor-infiltrating IL-17-producing gamma delta T cells support the progression of tumor by promoting angiogenesis[J].Eur J Immunol，2010，40（7） ：1927-1937.
[3]Tao H，Mimura Y，Aoe K，et al.Prognostic potential of FOXP3 expression in non-small cell lung cancer cells combined with tumor infiltrating regulatory T cells[J].Lung Cancer，2012，75（1） ：95-101.
[4]Chen C， Chen D，Zhang Y，et al.Changes of CD4+CD25+FoxP3+ and CD8+CD28-regulatory T cells in non-small cell lung cancer patients undergoing surgery[J]. Int Immunopharmacol，2014，18（2） ：255-261.
[5]Maruyama T， Kono K， Mizukami Y， et al.Distribution of Th17 cells and FoxP3（+） regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes，tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer[J].Cancer Sci，2010，101（9） ：1947-1954.
[6]Kryczek I， Wu K， Zhao E， et al.IL-17+ regulatory T cells in the microenvironments of chronic inflammation and cancer[J].J Immunol，2011，186（7）：4388-4395.
[7]Li S， Li Y， Qu X，et al. Detection and significance of TregFoxP3（+） and Th17 cells in peripheral blood of non-small cell lung cancerpatients[J].Arch Med Sci，2014，10（2）：232-239.
[8]李莎，李岩，梁婧，等.非小细胞肺癌患者外周血FoxP3+调节性T细胞和Thl7的检测与临床意义[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32（7） ：642-646.
[9]Zhao L，Yang J，Wang HP，et al.Imbalance in the Th17 /Treg and cytokine environment in peripheral blood of patients with adenocarcinoma and squamous cell carcinoma[J].Med Oncol，2013，30（1）：461-468.
[10]Tosolini M， Kirilovsky A，Mlecnik B，et al.Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells （Th1，th2，treg，th17） in patients with colorectal cancer[J].Cancer res，2011，71（4）：1263-1271.