关键词：牛；原核表达；SPAG11D基因；抑菌作用
Key words： bovine； prokaryotic expression； SPAGLLD gene； antibacterial activity
雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能，如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动[5]。而SPAG 11蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的SPAG11各蛋白亚型研究表明，其N-端都具有抗菌活性，而且人的SPAG11C蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型N-端的抗菌活性[6，7]。此外还发现，猕猴的SPAG11蛋白也具有抗菌活性。
目前认为SPAG 11在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Zhou等[4]发现大鼠附睾头部的SPAG11E蛋白结合在精子的头部，在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部，这表明SPAG11E蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用，此外SPAG11E蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。
在牛体内共发现6种SPAG11蛋白亚型：SPAG11C、SPAG11D、SPAG11E、SPAG11U、SPAG11V、SPAG11W[8]，它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等[9]在牦牛生殖器官中也检测到了这6个亚型的表达。 1 材料与方法
1.1 试剂
Trizol试剂购自Invitrogen公司；cDNA反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、Hind III和 BamH I限制性内切酶均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购于Biolabs公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit质粒快速提取试剂盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；TEMED购自Amresco公司；异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Merck公司；氨苄青霉素（Amp）购自Sigma公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸钠（SDS）等均为国产分析纯试剂。
1.3 试验动物
刚出生的小公牛。
1.4 引物设计
1.5 SPAG11D基因的克隆和测序
用DNA凝胶回收试剂盒回收SPAG11D基因的PCR产物，连接于克隆载体PUC57，构建 PUC57-SPAG11D质粒并转化DH 5α感受态细胞，提取重组质粒，经双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。
1.6 原核表达载体的构建
1.7 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化
1.8 抑菌活性测定
2 结果与分析
2.1 SPAG11D基因的PCR扩增
SPAG11D基因的PCR的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，显示大小约 390 bp左右的片段，与预计的片段大小相符（图1）。
2.2 克隆载体的构建及鉴定
2.3 表达载体的双酶切鉴定
经测序鉴定正确的克隆载体经Hind III和BamH I双酶切，克隆至原核表达载体pET-32a（+）上，构建表达载体pET-32a（+）-SPAG11D，转化DH5α感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆（图3）。
2.4 原核表达产物的检测及条件优化
检测了表达的重组蛋白在体外对霍乱弧菌O139、大肠杆菌K199、K88、O157、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌性。结果显示，重组蛋白对霍乱弧菌的生长有抑制作用（图6）。
3 讨论
SPAG11在精子成熟过程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有运动能力，Zhou等[4]发现大鼠附睾中未成熟精子与附睾上皮细胞或能表达SPAG11E（Bin1b）的小肠上皮细胞共同培养后具有了运动能力，而加入SPAG11E抗体后，未成熟精子不具有运动能力；此外还发现，精子的运动能力随SPAG11E表达量的降低而下降。牛的SPAG11D存在于发育后期的精子细胞中，且在精子细胞的尾部[8]，与大鼠SPAG11E相类似，可能与精子的运动能力相关。
鉴于牛SPAG11D在抵御微生物对机体的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表达了牛SPAG11D融合蛋白，且具有很强的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能将进一步分析研究。
参考文献：
[3] PATIL A A，CAI Y，SANG Y，et al.Cross-species analysis of the mammalian beta-defensin gene family： Presence of syntenic gene clusters and preferential expression in the male reproductive tract[J].Physiol Genomics，2005，23（1）：5-17.
[4] ZHOU C X，ZHANG Y L，XIAO L，et al.An epididymis-specific beta-defensin is important for the initiation of sperm maturation[J].Nat Cell Biol，2004，6（5）：458-464.
[7] HALL S H，YENUGU S，RADHAKRISHNAN Y，et al.Characterization and functions of beta defensins in the epididymis[J].Asian J Androl，2007，9（4）：453-462.