摘 要：利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳方法研究真空包装的冷却鹿肉贮藏过程中的菌相变化。将冷却鹿肉真空包装贮藏于0～2 ℃条件下，每隔5 d取出，利用细菌试剂盒提取细菌DNA，进行聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳分析，同时对16S rDNA V3 区的DGGE 图谱进行割胶测序，检测到贮藏末期主要是苏黎世克罗诺杆菌、斯氏普罗威登斯菌，棕色类香味菌，乳酸发酵类梭菌等成为优势腐败菌。
关键词：冷却鹿肉；真空包装；菌相变化；聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳
Microfloral Changes of Vacuum Packaged Venison during Chilled Storage
SHI He1， HU Tiejun2，*， QIN Fengxian3， CHEN Wei3， LIU Jing4， WANG Zhaohui5， JIA Dongshu6， WU Jun6，
YOU Lixin6， CHEN Haiyan6， YU Yan6， LIU Fang6， MA Jinxi6， YANG Bin6， ZHANG Tiehua7
（1. College of Agriculture， Yanbian University， Yanji 133002， China；
2. Jilin Dongao Deer Industry Science and Technology Development Co. Ltd.， Changchun 130600， China；
3. Engineering Research Center of Deer Industry of Jilin Province， Changchun 130600， China；
4. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Changchun 130062， China；
5. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；
6. College of Organism and Food， Changchun University of Science and Technology， Changchun 130600， China；
7. College of Quartermaster Technology， Jilin University， Changchun 130012， China）
Abstract： The microfloral changes of vacuum packaged venison during chilled storage were examined using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）. Samples were collected at 5-day intervals during the storage for bacterial DNA extraction using a DNA extraction kit before PCR-DGGE analysis. The band of 16S rDNA V3 region from the DGGE analysis was excised for sequence analysis. The dominant spoilage bacteria at the end of the storage included Cronobacter turicensis， Providencia stuartii， Myroides phaeus， Clostridium lactatifermentans.
Key words： chilled venison； vacuum packaging； microfloral change； PCR-DGGE
中图分类号：TS251.5 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）04-0015-05
doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201504004
冷却肉是指牲畜在屠宰前要严格执行兽医检疫，屠宰后的胴体迅速冷却，使其温度（以后腿内部为测量点在24 h内降到0～4 ℃，在之后的加工、运输和销售中始终保持在0～4 ℃范围内的鲜肉[1]。冷却肉相对热鲜肉，冷冻肉品质优良、滋味鲜美，且微生物生长受到抑制[2]。研究表明冷却鹿肉也具有冷却肉的独特优点。
畜体在屠宰加工过程中避免不了被细菌污染，存在肉类表面的细菌往往能很牢固地吸附在肉的表面 [3]。随着贮藏时间的延长，细菌的菌相构成会发生变化，凸显出优势菌群，引起冷却肉腐败变质[4]。
研究表明，由于各种细菌产生的代谢产物不同，对产品的腐败作用（腐败时间、腐败类型）不同。研究其贮藏过程数量和种类的变化，以便采取具有针对性的措施抑制优势菌群的生长繁殖[5-6]。变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技术在奶酪、香肠、酸面团、泡菜、葡萄酒等食品贮藏过程中微生物变化研究方面均有报道[7]。DGGE可不采用培养方法，而从食物样品中直接提取微生物的总DNA，检测到难以培养或不能培养的多种微生物，而且检测速度快。近年来，应用DGGE技术研究不同包装冷却肉贮藏过程中的菌相变化亦有报道[8-10]。 本实验将冷却鹿肉真空包装低温贮藏，在不同贮藏时期不经培养直接提取鹿肉中细菌DNA，应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技术，研究菌相变化，揭示贮藏末期主要优势腐败菌，了解其生物学特性，为进一步研究肉品的保鲜方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
采取长春世鹿集团刚屠宰的新鲜鹿后腿肉。
引物 金斯瑞生物科技有限公司；dNTP碱基、rTaq酶、pMD18-T Cloning Kit 美国TaKaRa公司；DNA纯化试剂盒、DH5α感受态细胞 天根生化科技（北京）有限公司；40%丙烯酰胺/甲叉（Acrylamide/Bis）
美国伯乐Bio-Rad公司；CTAB环境微生物DNA提取试剂盒、TAE Buffer缓冲液 北京博友顺生物科技有限公司；
去离子甲酰胺、过硫酸铵、尿素 美国Amresco公司；N，N，N’，N’-四甲基二乙胺 德国Sigma公司；AgNO3染色液、甲醛、冰醋酸、氢氧化钠、乙醇 国药集团化学试剂北京有限公司；聚丙烯酰胺胶回收纯化试剂盒（Poly-Gel DNA Extraction Kit） 美国Omega公司。
1.2 仪器与设备
Centrifuge 5415D离心机 德国Eppendorf公司；T-gradient PCR仪 德国Biometra公司；SDC-6恒
温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司；JY-SPFT电
泳仪 北京君意东方仪器有限公司；Gel-Doc2000凝胶成像仪 美国伯乐Bio-Rad公司；DHP-9052恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；ZHWY-100C摇床
上海智城分析仪器制造有限公司；DCode变性梯度凝胶电
泳仪 伯乐生命医学产品（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 前处理
在无菌室内分切为7块，分别编号为9.19、9.22、9.26、10.01、10.06、10.10、10.14，采用无菌多层复合包装袋分别进行真空热缩包装（真空度0.1 MPa，抽空时间40 s，热封温度90℃，热封时间3 s），0～4 ℃贮存，待测。
1.3.2 直接提取冷却鹿肉细菌DNA
无菌剪取一定肉样，用灭菌剪刀剪碎，精确称取5 g碎肉样，放入灭菌锥形瓶（内有100 mL灭菌生理盐水），摇床280 r/min、4 ℃条件振摇15 min[9，11]，静置5 min，取30 mL上清液于一灭菌离心管中，200 r/min离心5 min后，取15 mL上清液于另一灭菌离心管中，12 000 r/min离心10 min。离心所得沉淀，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取。分别于第0、5、10、15、20、25、30天测试。
1.3.3 细菌16S rDNA片段的PCR扩增
以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物
GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列。
PCR扩增体系（50 μL）如下：10×PCR Buffer缓冲液：5 μL；dNTP碱基（2.5 mmol/L）3.2 μL；rTaq酶
（5 U/μL）0.4 μL；上游引物GC-338F（20 μmol/L）1 μL；下游引物518R（20 μmol/L）1 μL；模板DNA 50 ng；补去离子水50 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。
PCR产物采用DNA Gel Extraction Kit纯化回收。
1.3.4 PCR-DGGE分析
取10 μL PCR的产物进行DGGE分析。采用变形梯度为35%～55%、8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素（7 mol/L）和40%丙烯酰胺溶液）在1×TAE缓冲液中150 V，60 ℃条件下电泳5 h。最后用终止液（乙醇50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL）终止反应。
DGGE完毕后、采用银染法染色：固定液（乙醇 50 mL、冰醋酸2.5 mL、定容500 mL）固定15 min；Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各1 次；银染液（硝酸银1 g、37%甲醛0.75 mL、定容500 mL）染色15 min； Milli-Q纯水清洗、20 s和2 min各1 次；显色液（氢氧化钠7.5 g、37%甲醛2.5 mL、定容500 mL）显色5～7 min。
1.3.5 DGGE图谱中优势条带的回收与测序
用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用Omega公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系如与1.3.3节。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。
将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。
1.4 数据分析
DGGE图谱采用Quantity one软件对每个样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析，测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析。 2 结果与分析
2.1 细菌16S rDNA的PCR扩增
以GC-338F和518R为引物扩增16S rDNA序列、得到约200 bp的DNA片段（图1）用于DGGE分析。
由图2、3可知，贮藏初期产生较多条带，表明鹿肉初始菌种类不多，细菌主要来自鹿肉在屠宰加工过程中环境污染；随着贮藏时间的延长，条带分布发生明显变化，一些条带逐渐变弱或消失，一些条带由弱变强，还出现一些新条带，表明细菌在冷藏阶段发生变化；至贮藏末期，亮条带在图谱上发生了很大的变化，表明贮藏过程中菌相组成发生了显著变化。结合图4量化分析胶图，初期菌种编号主要是2、3、4和6号，2号逐渐消失，3、4号逐渐减弱，但是一直存在；末期菌种编号主要是1、10、15、17和19号；贮藏过程当中，一直存在的菌种编号为3、4、7和13号。
2.3 主要电泳条带序列测定
DGGE凝胶条带回收后，以338F/518R为引物进行PCR扩增，获得约200 bp的DNA片段。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆测序。序列结果见表2。
每个回收条带选取3个克隆进行了序列测定。登录NCBI用BLAST在GenBank数据库中与参考序列进行相似性分析，结果如表2所示。各条带相似性在98%以上。由图3和表2可知，第0天时，肉中存在的初始污染菌主要有Cronobacter dublinensis（普罗威登斯菌，条带4）、Erysipelothrix rhusiopathiae（丹毒丝菌，条带6）等；而贮藏末期存在优势菌属主要有Cronobacter turicensis（苏黎世克罗诺杆菌，条带1）、Providencia stuartii（斯氏普罗威登斯菌，条带10）、Myroides phaeus（棕色类香味菌，条带15）、Clostridium lactatifermentans（乳酸发酵类梭菌，条带19）等，表明贮藏末期鹿肉中菌相相对贮藏初期复杂很多。有些条带未被测定，有些条带测定失败。
3 讨 论
冷却肉由于其品质优良滋味鲜美，越来越受到消费者的喜爱，故研究冷却肉中的优势腐败菌非常重要[11]。由于传统微生物培养操作步骤繁琐且鉴定出来的微生物数量有限，而PCR-DGGE能快速准确地分析出冷却肉菌相的变化，所以运用PCR-DGGE来分析冷却肉贮藏期间微生物的变化越来越流行[12]。
冷却肉在生产和流通过程中，虽然一直处于低温控制下（0～4 ℃），但仍然污染了一些嗜冷菌，如单核细胞李斯特增生菌和假单胞菌属等，它们在冷藏条件下仍会大量生长和繁殖，最终导致冷却肉发生腐败变质[13-16]。研究表明，引起冷却肉腐败最常见的细菌有假单胞菌属、放线杆菌、乳酸杆菌、黄杆菌、产碱杆菌和肠杆菌属的一些菌属[17]。Li Miaoyun等[13]运用DGGE方法研究真空包装猪肉贮藏期间菌相的变化，通过对细菌16S rRNA 基因V6～V8可变区的研究表明乳杆菌和热死环丝菌为其贮藏末期的主要腐败菌。于见亮[18]对冷却羊肉的初始菌相进行分析表明，冷却猪肉初始菌相主要有假单胞菌属、热死环丝菌、葡萄球菌、乳酸菌属、肠杆菌属，且假单胞菌属为冷却猪肉初始菌相的优势微生物。
由于在贮藏期间各个菌群的最适合生长条件是不同的，且菌群之间也存在一定的相互作用（拮抗、竞争、互利、共生），所以在贮藏期间菌群会随着时间的变化而变化，其中的一种或者几种会成为影响冷却肉腐败的优势菌群，其他菌群会慢慢减弱甚至消亡[19-21]。
本研究中2、3和4号样品失去了包装优势，而1、10、15和19号样品含量上升占为主要优势，成为冷却鹿肉腐败变质的主要菌群。可以根据这些细菌的生物学特性筛选出安全优质的天然保鲜剂，为以后进一步抑制使鹿肉变质的细菌提供可靠地理论依据。
4 结 论
本实验应用PCR-DGGE法对冷却鹿肉贮藏期间的菌相变化分析表明：在鹿肉贮藏初期主要细菌为Cronobacter dublinensis（普罗威登斯菌）、Erysipelothrix rhusiopathiae（丹毒丝菌）；贮藏中期斯氏普罗威登斯菌活力逐渐增强，并出现了Cronobacter turicensis（苏黎世克罗诺杆菌）、Providencia stuartii（斯氏普罗威登斯菌）、Myroides phaeus（棕色类香味菌）、Clostridium lactatifermentans（乳酸发酵类梭菌）等菌属；Erysipelothrix rhusiopathiae str. Fujisawa（丹毒丝菌属）、Aeromonas eucrenophila（嗜框泉气单胞菌）等菌属有一定的生存能力，随着时间的延长逐渐减少、消失；贮藏末期优势菌属为有Cronobacter turicensis（苏黎世克罗诺杆菌）、Providencia stuartii（斯氏普罗威登斯菌）、Myroides phaeus（棕色类香味菌）、Clostridium lactatifermentans（乳酸发酵类梭菌）。
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