摘要：试验以凉山半细毛羊为研究对象，采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-1基因的CDS全序列，生物信息学方法深入分析其序列。结果表明，IGFBP-1基因的CDS序列为792 bp，编码263个氨基酸，与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、76%和74%，氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%，GenBank登录号为FJ589639.1;IGFBP-1基因的氨基酸分子量为27.8 kD，理论等电点(pI)为5.99;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近，与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-1基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域，有一个信号肽、一个跨膜区、16个磷酸化位点、6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为61.98%、24.33%、13.69%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-1基因的功能奠定基础。
关键词：IGFBP-1基因;克隆;绵羊
Abstract： Using Liangshan semi-fine wool sheep as material， the whole CDS sequence of IGFBP-1 gene was cloned with RT-PCR and analyzed its sequences by bioinformatics. The results showed that the CDS sequence of IGFBP-1 gene was 792 bp， encoding 263 amino acids. The CDS homology with bovine，human and rat was 97%， 76% and 74%， respectively. The amino sequence homology was 97%， 69% and 71%， respectively. Its accession number in GenBank was FJ589639.1. Its amino molecular weight was 27.8 kD. The theoretical isoelectric point(pI) was 5.99. The phylogenetic analysis showed that it was close to cattle and goat and far from chicken，fish，etc. The IGFBP-1 had obvious hydrophobic and hydrophilic region， a signal peptide， a transmembrane region，16 sites of phosphorylation， 6 sites of N- glycosylation and 8 sites of O-glycosylation. The random coil， α-helix and β-sheet region in secondary structure was 61.98%， 24.33%， 13.69%， respectively. The tetiary structure analysis showed that it had a IGFBP_N domain and a thyroglobulin-Ⅰ type of domain. It will provide a scientific basis for further studying the function of IGFBP-1 gene in sheep.
Key words： IGFBP-1 gene; clone; sheep
胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)是胰岛素样生长因子结合蛋白家族(IGFBPs)的成员之一，调节胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子Ⅱ的促有丝分裂和新陈代谢作用[1]，在低氧或饥饿、营养不良、糖尿病等不利条件下，哺乳动物外周和肝脏中IGFBP-1 mRNA水平显著增加[2]，降低IGFBP-1的水平，会导致葡萄糖耐受性降低、血压升高，甚至引起肥胖[3-5]，IGFBP-1能抑制依赖于IGF-I的细胞生长和分化[6]，高表达使生物池中IGF-I的可用量减少[7]，引起动物机体(如鼠)的出生体质量下降[8]。
Ou等[9]运用PIRA-RFLP技术检测北京油鸡的IGFBP-1基因5′的单核苷酸多态性，发现该多态性与北京油鸡群体的生长有密切关系，赵秀华等[10]采用SSCP技术检测京海黄鸡的IGFBP-1基因外显子的单核苷酸多态性，SNP位点对京海黄鸡生长性状具有一定的影响。有关绵羊IGFBP-1基因的序列分析、单核苷酸多态性等报道较少，本研究以凉山半细毛羊为研究对象，克隆了IGFBP-1基因的全CDS序列，利用生物信息学方法分析CDS序列及相应的氨基酸序列，为进一步研究该基因在绵羊生长发育过程中的调控以及标记的辅助选择育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以四川省凉山州布拖县的凉山半细毛羊原种场7～9月龄的凉山半细毛羊母羊为试验材料，采用颈静脉放血，宰杀后10 min内收集肝脏组织，浸泡于Sample Protector(宝生物)试剂中，置放于液氮中保存，带回实验室于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2 引物设计
参照NCBI GenBank数据库中公布普通牛(Bos Taurus)的IGFBP-1基因(NM_174554)的mRNA序列，采用Prime 5.0软件设计引物，Oligo 6.0进行引物评价，采用NCBI网站的BLAST工具检索比对以验证引物特异性，IGFBP-1引物序列为F：5′-TGGCGATGCCCGAAGTCCT-3′，R：5′-GCATCTGTTTT CAGTTCTGTAAG-3′，引物由大连宝生物公司合成。
1.3 总RNA的提取
取凉山半细毛羊肝脏组织约100 mg，迅速放入预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至组织被研磨成粉末状，提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性，核酸蛋白检测仪检测RNA提取的浓度与纯度，提取的RNA置于-80 ℃保存备用。
1.4 RT-PCR扩增
反转录反应按PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒(TaKaRa公司)进行，反转录反应条件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s终止反应。以合成的第一条cDNA链为模板，以IGFBP-1基因的特异性引物进行PCR扩增，扩增体系为50 μL，扩增条件为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，62 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。
1.5 RT-PCR产物克隆
将回收的RT-PCR产物与PMD 18-T载体连接，根据凝胶电泳或核酸蛋白仪检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。轻轻蜗旋离心管以混合内容物，短暂离心，将混合反应液置于16 ℃水浴中过夜连接。用灭菌牙签挑取单个白色菌落，接种于含有氨苄的1.5 mL LB培养液中，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜。次日，吸取1 μL菌液作模板，依据RT-PCR扩增的体系和条件进行PCR鉴定，通过1%琼脂糖凝胶电泳来检测目的条带。据菌液PCR检测结果，吸取含有目的条带的1 mL菌液，送往Invitrogen公司测序。
1.6 生物信息学分析
将测序结果与测序峰图结合进行校对，寻找基因的起始密码子与终止密码子，确定基因的编码区序列。用NCBI的Blast服务器和Clustal W软件进行序列的同源性分析。核酸序列与其他物种比对后，利用Expasy服务器(http：//au.expasy.org/tools/)相关软件预测各个基因的氨基酸序列的分子量、等电点和氨基酸组成等，将序列提交到ExPASy ScanProsite、HNN、SWISS-MODEL服务器，预测蛋白质的磷酸化位点、N-磷酸化位点、O-磷酸化位点、跨膜区、信号肽、疏水性、二级结构和功能域等。
2 结果与分析
2.1 总RNA提取及RT-PCR扩增
凉山半细毛羊肝脏组织中提取到的总RNA，经1%琼脂糖电泳后可以清晰地观察到3条带，如图1所示，以迁移率从大到小依次是5S rRNA、18S rRNA、28S rRNA，28s条带亮度大约为18S条带的2倍，5S条带亮度较低，总RNA样品完整、降解较少、质量良好。以凉山半细毛羊的肝脏组织的cDNA为模板，用IGFBP-1基因的引物扩增，得到的长度约800 bp，凝胶电泳检测结果如图2所示。
2.2 序列分析
根据正反测序进行校正，采用DNAMAN去除载体序列和寻找上下游引物序列，确定各个基因编码氨基酸的CDS区域，IGFBP-1基因的完整CDS序列长度为792 bp，共编码263个氨基酸。利用NCBI中的Blast程序比对克隆的绵羊IGFBP-1基因与近源物种的同源性。同源性分析表明，IGFBP-1基因与牛、人、鼠的CDS区的同源性分别为97%、76%和74%，氨基酸序列同源性分别为97%、69%和71%;同源性比对结果显示克隆的基因即为绵羊的IGFBP-1，基因将PCR扩增得到的序列提交到NCBI数据库中，登录号为FJ589639.1。利用BioEdit软件对此次试验克隆得到的IGFBP-1基因的CDS编码区的碱基组成成分分析，IGFBP-1基因的A、C、G和T等4种碱基组成含量分别为20.96%、30.81%、29.42%和18.81%，单链分子量为241.9 kD，双链分子量为482.9 KD;IGFBP-1的氨基酸分子量为27.8 kD，理论等电点为5.99。
2.3 IGFBP-1基因的分子进化
从NCBI中GenBank数据库下载山羊、猪、牛、鼠、人、鸡和鱼类等物种的IGFBP-1基因的氨基酸序列，用Mega 6.06软件以Neighbor-Joining程序构建IGFBP-1基因的分子系统发育树，如图3所示。IGFBP-1基因与其他物种的进化关系跟传统的分类比较一致，绵羊与山羊关系最近，最先聚合，随着亲缘关系的远近逐步与牛、猪、人和鼠等哺乳动物聚为一支，再与鸡聚合，最后与来源于水生鱼类的一支聚合。
2.4 蛋白质特性预测
2.4.1 疏水性分析 蛋白质的疏水性分析采用ExPASy在线平台的ProtScale程序计算绵羊IGFBP-1的疏水性图谱，如图4所示。IGFBP-1的N段区域，存在明显的疏水性区域，而在N段及中部区域存在明显的亲水性区域。因此，预测IGFBP-1的中部区域是与IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因的结合部位，依据IGFBP-1N段的明显疏水性区域，在该位置可能存在信号肽。
2.4.2 信号肽分析 根据蛋白质的疏水性分析，IGFBP-1可能存在信号肽，将IGFBP-1的氨基酸序列提交到SignalP 3.0服务器(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。如图5所示，结果表明，IGFBP-1蛋白质的N段存在信号肽的概率为0.985，信号肽的长度为25个氨基酸残基，切割位置为Gly-Ala之间。
2.4.3 跨膜区分析 联网到“http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html”进行蛋白质的跨膜区预测，如图6所示。分析表明，IGFBP-1存在两个跨膜区，分别位于9～27和57～78位置处，9～27这个跨膜区刚好位于信号肽位置，因而该基因仅存在57～78位置处的一个跨膜区。 2.4.4 磷酸化和糖基化位点 利用NetPhos 2.0在线磷酸化位点预测服务器，对克隆的IGFBP-1的磷酸化位点预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/)如图7所示。IGFBP-1基因中共发现16个磷酸化位点，分别为Ser(11)、Thr(4)和Tyr(2)。
利用NetNGlyc1.0及NetOGlyc3.1服务器，对克隆的IGFBP-1的分子进行N-和O-糖基化位点预测(http：//www.cbs.dtu.dk/services/)。由图7可知，IGFBP-1氨基酸序列中共6个N-糖基化位点，分别位于141、157、161、209、211、260等位置;O-糖基化位点的预测如图3.11，IGFBP-1氨基酸序列中共8个O-糖基化位点，分别位于100、108、109、115、117、120、121、122等位置。
2.5 二级结构分析
利用HNN在线二级结构预测服务器对IGFBP-1二级结构预测(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)，如图7所示。IGFBP-1以无规卷曲为主，其次为α-螺旋，β-折叠最少。IGFBP-1的无规卷曲、α-螺旋、β-折叠区域分别占61.98%、24.33%、13.69%。
2.6 蛋白质功能域预测及分析
将序列递交到ExPASy ScanProsite(http：//www.expasy.org/tools/scanprosite/)结构域分析数据库，进行蛋白质结构域的查找与分析，如图8所示。克隆的IGFBP-1的N端具有一个IGFBP_N功能域序列，位于28-109;在C端，具有一个甲状腺球蛋白-Ⅰ型域，位置为177-255，在该域中，具有3个二硫键，位置为180-210、221-232、234-255，同时还具有大量的N-豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和蛋白激酶C等磷酸化位点;在IGFBP-1(197-203，Kag.Dkl.Y)中具有酪氨酸激酶磷酸化活化位点、一个细胞粘附序列(250-252，RGD)和一个酰胺化位点(239-242，sGKR)。
3 小结与讨论
细胞的生长、繁殖和存活依赖于细胞间的动态分子调节过程，在这种复杂的生命活动过程中，蛋白质分子扮演着重要的中介角色，在蛋白质与蛋白质、代谢物、磷脂、碳水化合物及核酸之间发挥极其活跃的作用。人类基因组直接得到的初始蛋白质结构并不能充分地解释蛋白质所表现的多种功能及其相互调节机制，几乎所有的蛋白质都要经过各种形式的修饰[11]，在线预测显示IGFBP-1存在大量的磷酸化和糖基化等修饰过程，IGFBP-1是羊水中IGF-Ⅰ的主要结合蛋白，生理作用依赖于不同的磷酸化[12，13]，IGFBP-1的磷酸化提高了与IGF-Ⅰ的亲和力，调节IGF-Ⅰ的活性，特别是IGF-Ⅰ关于胎儿与胎盘的生长[14]。人的Ser101是一个独特的磷酸化位点，与IGF-Ⅰ的结合极为重要，Ser19的磷酸化也能提高与IGF-Ⅰ的结合，而在Ser169和Ser98的磷酸化位点并不与IGF-Ⅰ的结合表现为相关性，IGFBP-1的Ser98、Ser101、Ser119和Ser169等磷酸化位点是胎儿适应性应答于低氧和营养限制的一种新机制[15]。
蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上特定的氨基酸残基共价结合的过程，蛋白质糖基化可以按照氨基酸和糖的连接方式分为四类：O-糖基化、N-糖基化、C-甘露糖化以及GPI锚定连接[16]。O-糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏氨酸残基上，糖基化位点处的蛋白多为β构型，O-多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖。N位糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖的过程，一般认为N-糖基化发生在蛋白Asn-Xaa-Ser/Thr序列上[17]，少数情况下Asn-Xaa-Cys序列也作为糖基化位点[16]。IGFBP-1的氨基酸序列中存在6个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点。
IGFBP-1在保守的N-端区域存在12个Cys，形成6个二硫键，其二硫键是以相邻的2个Cys依次而构成，形成IGFBP-1的第一亚域，在C-端的保守区域内存在6个Cys，以相邻两个Cys依次而构成3个二硫键，构成第二亚域，在绵羊的IGFBP-1基因的氨基酸序列的二硫键跟人的研究一致[18，19]，经二硫键折叠形成稳定精细的IGFBP-1的球状结构，保证了与IGFs结合的亲和力。在IGFBP-1N-端具有一个完整IGFBP_N功能域和在C-端具有一个甲状腺球蛋白-1，从而表现出IGFBP-1与IGF-I结合的功能以及自身的独特功能。
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