摘要：为测定人工种植的金莲花（Trollius chinensis Bunge）中多糖提取率和探索超声波辐射辅助下多糖提取的最佳工艺，并通过人工种植与道地野生的金莲花中多糖提取率的比较，实施对人工种植金莲花的药用品质评价；试验在超声波辐射下，用水提醇沉法提取金莲花多糖、三氯乙酸法除去蛋白、苯酚-硫酸法测多糖含量，通过单因素试验和正交试验，比较了超声波辐射条件下超声波辐射功率、超声波辐射时间、料液比、提取温度对多糖提取率的影响。结果人工种植的金莲花多糖提取率为2.94 %，最佳提取工艺条件是超声波辐射功率300 W、料液比1∶25、超声波辐射时间30 min、提取温度80 ℃。这个结果显示人工种植的金莲花多糖含量较高，完全能满足药用需求。
关键词：金莲花（Trollius chinensis Bunge）；人工种植；多糖；提取工艺；药用品质；评价
中图分类号：Q949.746.5；Q539；R282.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5456-04
植物多糖具有抗感染、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒、降血糖、降血压和增强机体免疫力等重要的药理作用[1]，且植物多糖来源广泛、毒副作用低、安全性好、无致癌作用[2]。中药金莲花为毛茛科（Ranunculaceae）植物金莲花属（Trollius L.）金莲花（T. chinensis Bunge）的花、花蕾干燥品，其味苦、性寒、无毒，可治疗口疮喉肿、浮热牙宣、耳疼目痛等症[3]。现代药理研究表明，金莲花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治疗慢性扁桃体炎、急性鼓膜炎、发烧、感冒、尿路感染等病。研究表明，金莲花中主要含有黄酮类、有机酸、糖类、蛋白质等[4]成分；目前对野生金莲花的蛋白质、黄酮类、有机酸类化合物的提取分离和药理活性进行了广泛的研究[5-9]，而对人工种植的金莲花和野生金莲花的多糖提取分离的报道不多。随着市场需求量的不断增加，野生金莲花已经远远不能满足需求；近年来各地人工种植金莲花的规模越来越大，人工种植金莲花的药用品质也越来越受到广泛的关注。试验对超声波提取多糖的影响因素及工艺条件进行了探索与优化，分析了宁夏回族自治区隆德县种植的金莲花多糖的提取率，通过人工种植与道地野生金莲花多糖提取率的比较，对人工种植金莲花的药用品质进行了评价。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
试验用试剂有石油醚、丙酮、80%乙醇、95%乙醇、苯酚、H2SO4（98%）、NaOH、葡萄糖、无水乙醇、CHCl3、正丁醇等，均为国产分析纯，水为纯净水。
仪器主要有UV-2450型紫外可见光分光光度计（日本株式会社岛津制作所）、FW-177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）、101-1AB型电热恒温鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）、DZ-2BCII标准型真空干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）、750型超声波处理器（美国Sonica公司）、 pHs-2C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）、RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、L-S电子天平（梅特勒-托利多仪器公司，感量万分之一）。
1.2 药材及处理
人工种植的金莲花采自宁夏回族自治区隆德县西北中药材有限责任公司种植基地；分别产于山西省五台山、河北省承德市、吉林省长白山、内蒙古自治区赤峰市的野生金莲花购于宁夏明德中药饮片有限公司，由注册药剂师鉴定。将人工种植和野生的金莲花样品分别放入恒温箱中，烘干至恒重，取出后自然阴干，粉碎，过80目筛，依次用石油醚、丙酮处理2 次，除去脂类和色素，再用80 %乙醇处理2次，除去单糖、低聚糖苷类等物质，干燥至恒重，得到预处理的5个产地的金莲花样品，备用。
1.3 多糖提取方法
1.3.1 标准曲线的建立 取适量葡萄糖于电热恒温鼓风干燥箱中105 ℃烘至恒重[10]，精确称取10.0 mg，加纯水溶解并定容至100 mL，配置成质量浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。分别精确移取葡萄糖标准液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于25 mL具塞刻度试管中，再分别以纯水补至2.0 mL，依次加入5 %苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，振摇均匀，静置 20 min；以不加葡萄糖标准液的空白为参比，在分光光度计490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为横坐标（x），相对应的葡萄糖含量为纵坐标（y），则标准方程为：y=0.083 3 x-0.000 67，R2=0.998 7；这个方程表明，葡萄糖标准品与吸光度具有良好的线性关系。
1.3.2 金莲花多糖的提取 准确称取预处理的金莲花样品1.00 g，加适量纯净水于50 ℃浸泡，按各种提取条件（料液比、超声波辐射功率、超声波辐射时间、提取温度）进行超声波提取；在4 000 r/min离心15 min后取上清液，将滤渣在同样的条件下再浸提1次，合并2次所得滤液，减压浓缩，向浓缩液中加入1/4体积的5 %三氯乙酸溶液，混合30 min，3 500 r/min 离心10 min，取上清液，重复2 次，至无明显沉淀为止。向上清液中缓缓加入95%的乙醇，并用玻璃棒缓慢搅拌，使乙醇浓度达到80 %。静置 4～5 h，4 000 r/min 离心 5 min，过滤沉淀物即为粗多糖，再于40 ℃环境中真空干燥，干燥后称重。
1.3.3 多糖含量的测定 准确称取 20.00 mg多糖粗品溶于水中， 定容于250 mL 容量瓶中，用分光光度计测定波长490 nm处的样品吸光度，按下式计算多糖提取率。
多糖提取率=[（m1×y×250）/20×m2]×100%；
式中，m1为从金莲花样品中提取的粗多糖质量（g），m2为金莲花样品质量（g），y为标准方程计算所得到的多糖质量浓度（mg/mL）。 1.4 多糖提取工艺试验
1.4.1 单因素提取比较 ①料液比对多糖提取的影响。称取1.00 g预处理的人工种植金莲花样品5份，设置超声波辐射功率300 W、提取温度80 ℃、超声波辐射时间30 min、浸泡时间60 min，料液比（金莲花样品∶水）处理分别设置为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，比较不同料液比处理对金莲花样品多糖提取的影响。② 超声波辐射功率对多糖提取的影响。称取1.00 g预处理的人工种植金莲花样品5份，设置超声波辐射时间30 min、料液比1∶25、提取温度80 ℃、浸泡时间60 min，超声波辐射功率处理分别设置为100、200、300、400、500 W，比较不同超声波辐射功率处理对金莲花样品多糖提取的影响。③ 提取温度对多糖提取的影响。称取1.00 g预处理的人工种植金莲花样品5份，设置超声波辐射功率300 W、料液比1∶25、超声波辐射时间30 min、浸泡时间60 min，提取温度处理分别设置为50、60、70、80、90 ℃，比较不同提取温度处理对金莲花样品多糖提取的影响。④ 超声波辐射时间对多糖提取的影响。称取1.00 g预处理的人工种植金莲花样品5份，设置超声波辐射功率300 W、料液比1∶25、提取温度80 ℃、浸泡时间60 min，超声波辐射时间处理分别设置为10、20、30、40、50 min，比较不同超声波辐射时间处理对金莲花样品多糖提取的影响。
1.4.2 正交试验筛选 为了综合考查多项提取因素对多糖提取率的影响，根据单因素处理的比较结果，试验采用L9（34）正交试验对提取过程中超声波辐射功率（A）、料液比（B）、提取温度（C）和超声波辐射时间（D）及不同水平进行了研究，并做方差分析，以筛选提取金莲花中多糖的最佳工艺条件。各因素与水平设置见表1。
1.4.3 验证试验 取预处理后的人工种植金莲花样品，在正交试验所得到的优化提取工艺条件下进行多糖提取，重复3次，取均值；以验证正交试验筛选结果的真实性与正确性。
1.4.4 不同产地野生金莲花与人工种植金莲花多糖提取率比较 将宁夏回族自治区隆德县人工种植的金莲花和分别产于山西省五台山、河北省承德市、吉林省长白山、内蒙古自治区赤峰市的野生金莲花经预处理后，在正交试验所得到的优化提取工艺条件下进行多糖提取，重复3次，取均值；比较4个产地野生金莲花与人工种植金莲花在多糖提取率方面的差异。
2 结果与分析
2.1 单因素处理对金莲花多糖提取的影响
2.1.1 料液比对金莲花多糖提取的影响 料液比对金莲花多糖提取的影响结果见表2。从表2可见，料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30处理后，金莲花多糖提取率依次为1.41%、1.49%、1.61%、1.64%、1.66%，表明多糖的提取率随料液比的降低而增加。分析认为，这是因为随着料液比的降低，溶剂与原料充分接触，增强了二者的传质作用，使多糖的提取率增大；但当料液比小于1∶25时，随着料液比的降低，提取率上升的幅度趋缓，可能是由于当金莲花的多糖绝大部分被溶出后提取率达到了一个稳定的水平所致；因此确定料液比1∶25为金莲花多糖提取的适宜料液比水平。
2.1.2 超声波辐射功率对多糖提取的影响 超声波辐射功率对金莲花多糖提取的影响结果见表2。从表2可见，超声波辐射功率分别为100、200、300、400、500 W处理后，金莲花的多糖提取率分别为1.38%、1.69%、2.16%、2.17%、2.19%，表明随着超声波辐射功率的增大，金莲花多糖的提取率也在增大，可能是随着超声波辐射功率的增大，对细胞的破坏作用增强，从而利于多糖的浸出。当超声波辐射功率超过300 W后，多糖提取率的增大明显趋缓；为节省能源起见，确定超声波辐射功率以300 W 为宜。
2.1.3 提取温度对多糖提取的影响 提取温度对金莲花多糖提取的影响结果见表2。从表2可见，提取温度分别在50、60、70、80、90 ℃时，金莲花的多糖提取率分别为1.13%、1.35%、2.16%、2.19%、2.17%，表明在60～80 ℃范围内，随着提取温度的升高，金莲花多糖的提取率在逐渐增大；而超过80 ℃时多糖提取率反而下降。考虑到防止多糖在高温下降解，故确定80 ℃是金莲花多糖提取的适宜温度。
2.1.4 超声波辐射时间对多糖提取的影响 超声波辐射时间对金莲花多糖提取的影响结果见表2。从表2可见，超声波辐射时间分别是10、20、30、40、50 min时，金莲花的多糖提取率分别为1.61%、1.65%、1.77%、1.75%、1.72%，说明随着超声波辐射时间的延长金莲花多糖的提取率在逐渐增加，以超声波辐射30 min时的提取率最高；但是当辐射时间大于30 min时，提取率反而降低。这可能是由于多糖的热稳定性较差，随着超声波辐射时间的增加造成部分多糖变性，使多糖提取率降低。因此试验确定的超声波辐射适宜时间是30 min。
2.2 多因素对金莲花中多糖提取的影响
根据单因素处理的比较结果，试验确定了4个因素的合理水平进行L9（34）正交试验，结果见表3。从表3的直观分析显示，影响金莲花多糖提取的最主要因素是温度，影响因素大小依次为C>B>D>A，即提取温度>超声波辐射功率>超声波辐射时间>料液比；最佳工艺条件是A2B3C2D2。方差分析结果显示（表4），超声波辐射下提取金莲花中多糖的影响因素是提取温度，而超声波辐射功率、料液比和超声波辐射时间对多糖的提取无显著影响，因此，在提取过程中应严格控制提取温度，并要把超声波辐射功率适当降低。
根据正交试验结果的直观分析和方差分析，综合考虑，最佳提取工艺为提取温度80 ℃、料液比1∶25、超声波辐射功率300 W、超声波辐射时间30 min。 2.3 验证试验
将预处理后的人工种植金莲花样品在提取温度80 ℃、料液比1∶25、超声波辐射功率300 W、超声波辐射时间30 min的提取工艺条件下进行多糖提取，结果见表5。从表5可见，用正交试验所得到的优化提取工艺进行提取的多糖提取率为2.94%，说明试验取得的提取工艺可行，达到了优化工艺的目的。
2.4 不同产地野生金莲花与人工种植金莲花的多糖提取率比较
中国的金莲花主要分布于河北、山西、内蒙古、新疆、四川、云南、吉林、陕西、甘肃、青海等省（自治区），其中山西、河北两省是传统的金莲花道地产地和栽培地[9]。试验用正交试验所得到的优化提取工艺对不同产地野生金莲花与人工种植金莲花的多糖提取率进行比较，结果见表5。从表5可见，宁夏回族自治区隆德县人工种植的金莲花与山西省五台山、河北省承德市、吉林省长白山、内蒙古自治区赤峰市出产的野生金莲花在多糖提取率上几乎一致，完全能满足药用需求。
3 小结与讨论
（1）利用正交试验法，在超声波辐射条件下提取金莲花多糖的影响因素依次为提取温度、超声波辐射功率、超声波辐射时间、料液比；最佳提取工艺为提取温度80 ℃、料液比1∶25、超声波辐射功率300 W、超声波辐射时间30 min。
（2）与道地野生金莲花中多糖提取率比较，宁夏回族自治区隆德县人工种植的金莲花中多糖含量与相关产地野生金莲花的差异不大，因此可以满足药用需求。
不过影响金莲花中多糖提取率的因素比较多，除了人工种植与野外生长的在多糖提取率方面会产生差异外，还可能在栽培（生长）地点、生长发育时间、气候、土壤养分等方面出现差异。
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