分离技术是中药现代化过程的共性关键技术之一，是辨识中药药效物质的重要手段，中药产品质量的提高，筛选确黄连为研究对象，以获取黄连总生物碱为研究主线轴，在正向剔除非生物碱类成分的过程中采用醇提法、浓缩醇沉法、明胶沉淀法和大孔树脂法，制备不同分离单元的黄连提取物，并分别对其中总生物碱和小檗碱的含量进行跟踪分析，考察二者转移率变化规律，以评价黄连提取物过程的各分离技术的适用性。
1 仪器与试药
1.1 仪器WJN-50多功能真空浓缩机(韩国);KH-400KDE超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);需剂充型号梅特勒电子天平(万分之一);UV1102紫外分光光度计(岛津);L-2000日型立型高效液相色谱仪;恒温水浴锅(HH-2型，北京科伟);LGJ-10C型冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司);L-520型离心机(湖南赛特湘仪离心机有限公司)。
1.2 试药黄连药材(购于西安市盛兴中药饮片有限公司);盐酸小檗碱对照品(中国药品食品检定研究院，供含量测定用，批号：110733-200806);D-101型大孔吸附树脂(西安蓝晓科技有限公司提供);水为双蒸馏水，甲醇、乙睛为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
参考文献资料，本实验采用醇提法、浓缩醇沉法、明胶沉淀法和D101大孔树脂法制备不同的黄连提取物，以小檗碱和总生物碱为指标，对不同提取物进行定量分析，建立不同伴生物质组成的黄连总生物碱的制备工艺。
2.1 分离技术路线
2.2 各分离单元黄连总生物碱的制备
2.2.1 乙醇回流提取称取黄连药材2 kg，加40%乙醇(9倍、5倍、4倍)回流提取3次，第1次提取1.5 h，第2、3次分别提取45 min，合并3次醇提液，浓缩至7700 mL(即每1 mL相当于0.26 g原药材)，取250 mL留样，进行冷冻干燥(-50 ℃，0.01～0.02MPa，30h)、研细，即得样Ⅰ。
2.2.2 醇沉将
2.2.1项下其余7450 mL浓缩液加入乙醇使其含醇量达80%，静置24 h，倾出上清液，其余混悬液离心(4000 r/min，5 min)，收集离心沉淀得样Ⅱ，上清液合并，减压回收乙醇并浓缩、调整至4800 mL，取250 mL留样，冷冻干燥(-50 ℃，0.01～0.02MPa，30 h)、研细，即得样Ⅲ。
2.2.3 明胶沉淀将
2.2.2项下其余4550 mL浓缩液加入含10%NaCl的4%明胶溶液，搅拌均匀，加入乙醇，慢加快搅使含醇量达80%，静置24 h，倾出上清液，混悬液离心(4000 r/min，5 min)收集离心沉淀得样Ⅳ，上清液合并，减压回收乙醇浓缩、调整至4500 mL，取250 mL留样，冷冻干燥(-50 ℃，0.01～0.02MPa，30 h)、研细，即得样Ⅴ。
2.2.4 大孔吸附树脂分离将2.2.3项下其余4250 mL浓缩液，过预处理的D101树脂，柱体积为2200 cm3，以1.5BV/h的洗脱速度，依次用去离子水、40%乙醇、95%乙醇进行洗脱。分别收集水洗脱液、40%乙醇洗脱液、95%乙醇洗脱液，回收溶剂并减压浓缩至500 mL、2800 mL、500 mL，冷冻干燥(-50 ℃，0.01～0.02MPa，30 h)、粉碎，依次得到样品Ⅵ(水洗)样品Ⅶ(40%乙醇洗)样品Ⅷ(95%乙醇洗)。
2.3 主要成分含量测定
2.3.1 UV法测定黄连总生物碱
2.3.1.1 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品11 mg，用甲醇定容至10 mL量瓶中。再精密吸取5 mL，加甲醇稀释定容至50 mL，即得对照品溶液。
2.3.1.2 供试品溶液的制备称取黄连药材粗粉约0.2 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，静置至室温，称定重量，加甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤即得。精密称取样Ⅰ、样Ⅲ、样Ⅴ、样Ⅶ各约0.01 g，置50 mL量瓶中，加45 mL甲醇，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，静置至室温，加甲醇至刻度。分别精密移取0.2 mL，定容至5 mL，即得供试品溶液。
2.3.1.3 测定波长的选择甲醇为空白溶液，取盐酸小檗碱对照品溶液进行全波长紫外扫描，在348nm处具有最大吸收峰，因此将348nm作为测定盐酸小檗碱的最大吸收波长。
2.3.1.4 标准曲线绘制分别精密吸取上述盐酸小檗碱对照品溶液0.2 mL、0.3mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，于348nm处测定吸光度。经线性回归分析，盐酸小檗碱含量在0.022 mg/mL～0.066 mg/mL浓度范围内，线性关系良好，回归方程y=98.818x+0.0292，r=0.9993。
2.3.1.5 精密度试验取同批次供试品溶液5份，测定其吸光度，RSD值为0.62%，说明仪器精密度良好。
2.3.1.6 重复性试验取同批样品5份，按照2.3.1.2项下方法制备供试品溶液，测定其吸光度，RSD%值为0.83%，说明方法重复性良好。
2.3.1.7 稳定性试验取同批次供试品溶液5份，分别于0、1、2、4、6 h进样测定，RSD%值为0.76%，说明样品稳定性良好。
2.3.1.8 样品溶液的含量测定以甲醇为空白对照，取样Ⅰ、样Ⅲ、样Ⅴ、样Ⅶ，于348 nm处测定吸光度，总生物碱含量以盐酸小檗碱计算。
2.3.2 HPLC法测定小檗碱含量
2.3.2.1 对照品溶液制备取经真空干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得。
2.3.2.2 供试品溶液制备称取黄连药材粗粉约0.2 g，置具塞锥形瓶，加入甲醇-盐酸(100：1)的混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，静置至室温，称定重量，加甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液2 mL，加甲醇定容至10 mL，摇匀，滤过，取续滤液即得。精密称取样Ⅰ、样Ⅲ、样Ⅴ、样Ⅶ各约0.005 g，置10 mL量瓶中，加入甲醇溶液10 mL，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)30 min，静置至室温，加甲醇至刻度，即为供试品溶液。
2.3.2.3 标准曲线绘制精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液3 L、5 L、10 L、15 L、20 L，进样分析测定峰面积。以峰面积为纵坐标，小檗碱进样量为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程y=906783x+1611371，r=0.9996，结果表明小檗碱含量在0.36 g～2.4 g之间时，进样量与峰面积线性关系良好。
2.3.2.4 精密度试验精密吸取对照品溶液10 L，重复进样5次，计算小檗碱峰面积，RSD%值为0.68%，说明仪器精密度良好。
2.3.2.5 稳定性试验精密吸取供试品溶液10L，分别于0、2、4、6、8 h进样分析，计算小檗碱峰面积，RSD%值为1.32%，说明小檗碱在8 h内稳定性良好。
2.3.2.6 重现性试验取同批样品5份，按照2.3.2.2项下方法平行制备5份供试品溶液，分别进样分析，计算小檗碱峰面积，RSD%值为1.21%，说明方法重复性良好。
2.3.2.7 加样回收率试验精密称取已知含量的样品，分别精密加入一定量的盐酸小檗碱对照品，按供试品溶液制备方法和色谱条件测定，测得平均回收率为98.49%，RSD%为1.20%。
3 小结
同一种中药在正向剔除分离过程中，所采用分离技术的不同，所获得的提取物中各成分的种类与数量具有一定的差异。本文笔者分析研究黄连各分离单元提取物成分，结果表明黄连乙醇提取液，经浓缩、醇沉、明胶沉淀、D101型大孔树脂吸附与洗脱等分离技术所获得各提取物，其总生物碱和小檗碱的转移率均较高;亦表明正向剔除过程中的系列分离技术联合应用的工艺路线有效、可行。此项工艺研究为我们进一步开展黄连提取物体系体内特征参数奠定了基础。
