沉香是瑞香科植物受到自然或人为破坏后在自我修复过程中分泌的油脂或受到真菌的感染所凝结的分泌物，是一种传统名贵中药材，据本草纲目记载：沉香有去恶气、清人神、补五脏、益精壮阳等多种功效，同时沉香也是一种名贵天然香料，清闻淡雅舒心，熏燃时散发出的独特香气闻之更令人神安气爽。
目前白木香树主要的经济价值在于沉香的提取，白木香树结香部位位于树干，树干结香周期长且取香后对树木的损伤极大，并且取香后树枝、树叶以及不含油脂的树干、树叶往往被废弃，造成目前白木香树整体资源利用率很低，难以取得明显的经济效益，为了拓宽沉白木香树的药用价值和挖掘其提取物在香精香料行业的应用潜能，采用酶法与超临界CO2萃取联用方法提取白木香树叶挥发油，并和单独使用超临界CO2萃取法以及传统的水蒸气蒸馏法在得油率上进行对比，然后对各种方法制得的挥发油进行GC-MS分析，以期为白木香资源在香精香料行业的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
沉香叶：广东省茂名市化州沉香研发基地有限公司提供。
复合酶(-葡聚糖酶(350万 U/mL);纤维素酶(15万 U/mL);半纤维素酶(150万 U/mL);果胶酶(1万 U/mL);四种酶体积比1︰2︰1︰1)：上海丹尼悦生物科技有限公司;无水硫酸钠、无水乙醇：上海三爱思试剂有限公司;蒸馏水：实验室自制。
1.2 仪器与设备
TE-MT-10 型多功能提取罐：上海沃迪自动化装备股份有限公司;JYT-LJ 挥发油提取器：上海矩源机械设备有限公司;6890N 气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司;RE-52A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂生产;HPE-500Pilot 超临界CO2萃取机：德国Eurotechnica公司;HH-1 电热水浴锅：上海越众仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 水蒸气蒸馏法
参照中国药典附录XD挥发油测定法甲法，将白木香树叶干燥后粉碎，过50目筛网，精密称取200 g，置于挥发油提取器中，加入1.5 L蒸馏水，使用水蒸气蒸馏提取5 h，分液漏斗分离，收集上层油状液体并使用无水硫酸钠进行干燥，得到白木香叶挥发油提取物。
1.3.2 超临界CO2萃取
将白木香树叶干燥后粉碎，过50目筛网，精密称取200 g，装入超临界CO2萃取釜中，使用100 mL体积分数为95%的乙醇作为夹带剂，设定萃取温度45 ℃、萃取压力为25 MPa、萃取时间为2 h，CO2流体流量25g/min，分离釜压力10 MPa，分离釜温度55 ℃，减压蒸馏提取液至无醇味得到白木香叶挥发油。
1.3.3 酶法和超临界萃取联用工艺
将白木香树叶干燥后粉碎，过50目筛网，精密称取200 g，置于圆底烧瓶中，加入1.0 L蒸馏水，加入相对于白木香叶质量0.5%的复合酶，50 ℃水浴恒温2 h，之后将瓶中液体和残渣倒入多功能提取罐中，加入1.0 L无水乙醇，热回流提取两次，每次1h，合并滤液，然后使用旋转蒸发仪进行减压浓缩得浸膏，将得到的浸膏按1.3.2节的工艺进行超临界CO2萃取，减压蒸馏提取液至无醇味得到白木香叶挥发油。
2 结果与分析
2.1 挥发油得率
三种工艺制备挥发油的得率比较，水蒸气蒸馏法为提取挥发油的传统方法，使用该方法从白木香树叶中提取挥发油的得率为0.065%，与刘玉峰等报道的0.072%、张伟等报道的0.068%接近。
超临界萃取在中草药有效成分萃取领域的应用越来越广泛，具有低温、快速、无毒、无溶剂残留等优点，试验使用超临界萃取提取沉香叶挥发油的得率为0.142%，相比水蒸气蒸馏法有较大提高，说明加入乙醇作为夹带剂的超临界CO2流体具有更好的挥发油萃取能力，但是0.142%的萃取得率会对工业化生产带来较大的原料成本问题。
2.2 化学成分分析
三种工艺提取的挥发油化学成分如表1中所示，水蒸气蒸馏法提取的白木香叶挥发油主要成分为饱和脂肪酸、脂肪醇、酯类化合物，如十一烷酸(7.82%)、十二烷酸(8.14%)、十三烷酸(5.82%)、十四烷酸(7.69%)、十二烷醇(8.14%)、十三烷醇(5.78%)、十四碳酸甲酯(7.69%)和顺式-9-十八碳烯酸甲酯(3.45%);含 有 少 量 的 致 香 成 分 ， 如 具 有 清 灵 甜 果 香 的丁酸乙酯(0.09%)、具有留兰香的左旋香芹酮(0.12%)、具有烟草特征清香的新植二烯(0.39%)和燃烧时具有沉香特征香味的木焦醇(0.45%)。相比水蒸气蒸馏方法，超临界萃取挥发油的脂肪酸含量降低了20%左右，酯类成分提高10%左右，挥发油组分数目有所增加，如金合欢基丙酮(0.24%)、角鲨烯(3.34%)、(-)-地芰普内酯(2.04%)、有类似柠檬香味的柠檬烯(0.36%)、具有甜花香的甲位紫罗兰酮(0.16%)、类似紫罗兰香的乙位紫罗兰酮(0.17%)和类似麝香香味的二氢猕猴桃内酯(0.93%)。
从酶法和超临界萃取联用工艺提取的挥发油的化学成分来看，酶处理显著增加了左旋香芹酮、新植二烯、紫罗兰酮的、木焦醇所占的比例，而且检测出了单独使用超临界萃取所没有得到的物质：对甲氧基苯乙酮(0.34%)、2-十一烯醛(0.25%)、水杨酸苄酯(0.45%)、三甲基吡嗪(0.15%)、芫花素(0.18%)、-谷甾醇(0.14%)、4，, 7-二甲氧基-洋芹素，其中对甲氧基苯乙酮具有类似山楂、银白金合欢花、香水草的香气，2-十一烯醛具有醛香、蜡香、柑橘香、脂肪香、青香，水杨酸苄酯具有弱甜香，三甲基吡嗪具有浓郁的奶香。
3 结论
研究使用水蒸气蒸馏、超临界萃取、酶法与超临界萃取联用工艺从白木香叶中提取挥发油，并使用GC-MS对挥发油成分进行分析，主要得到以下结论：
1) 三种工艺提取挥发油的得率顺序为酶法与超临界萃取联用超临界萃取水蒸气蒸馏，使用复合酶对树叶进行预处理能有效破坏细胞壁结构，使细胞内有效成分更容易进入萃取流体，从而能明显提高萃取产率。
2) 水蒸气蒸馏法提取的白木香叶挥发油鉴定出成分40种，主要为为饱和脂肪酸、脂肪醇、酯类化合物，含有少量致香成分丁酸乙酯、左旋香芹酮、焦木醇。
3) 超临界萃取法提取的白木香叶挥发油鉴定出成分47种，相比水蒸气蒸馏法，饱和脂肪酸相对含量降低20%左右，酯类成分提高10%左右，增加了几种组分，分别为：合欢基丙酮、角鲨烯、(-)-地芰普内酯、柠檬烯(0.36%)、甲位紫罗兰酮、乙位紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯。
4) 酶法与超临界萃取联用工艺提取的白木香叶挥发油鉴定出成分48种，相比单独使用超临界萃取，丁酸乙酯、左旋香芹酮、焦木醇相对含量有所提高，并且出现了新的组分：对甲氧基苯乙酮、2-十一烯醛、水杨酸苄酯、三甲基吡嗪、芫花素、-谷甾醇和4，7-二甲氧基-洋芹素。
5) 综合对比分析，酶法与超临界联用工艺提取白木香叶挥发油在得率和致香成分丰富性等方面都有明显的优势，虽然成分上和含油脂沉香有明显区别，但是也有望在香精香料行业得到开发利用。
