摘要：通过对3种李斯特菌菌体蛋白提取方法主要是破壁方式的比较，找到一种可高效提取李斯特菌菌体蛋白的方法，为该菌的深入研究提供可靠技术。以绵羊李斯特菌新鲜液体培养物为材料，收集菌沉淀，分别选用3种破壁方式破除细胞壁，三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）-丙嗣沉淀法沉淀破壁液中的菌体蛋白，采用聚丙稀酰氨凝胶电泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）和Western-blot分析所得菌体蛋白。溶菌酶-超声破壁-TCA-丙酮沉淀法提取得到的李斯特菌菌体蛋白SDS-PAGE条带清晰丰富，Western-blot条带特异。溶菌酶-超声破壁-TCA-丙酮沉淀法可有效提取李斯特菌菌体蛋白，满足常用蛋白分析技术的要求，是一种提取李斯特菌菌体蛋白的可靠方法。
关键词：李斯特菌；蛋白质；提取；超声破壁
中图分类号：Q71 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0029-05
ComparisonofThreeMethodsforExtractionofNon―secretedProteinsfromListeria
XUZong-kai，LINQing-qing，ZHOUMeng-ying，LIUSi-jing，HUANGYao，LIWen-xi，LIXing-qiao，YUQian，WANGChuan
（DepartmentofPublicHealthLaboratorySciences，WestChinaSchoolofPublicHealth，SichuanUniversity，Chengdu610041，Sichuan，China）
Abstract：Threemethodsofextractingnon-secretedproteinsfromListeriawerecompared，mainlydifferentinlysisprocess，toobtainanefficientnon-secretedproteinsextractingmethodforListeria，toprovideareli?abletechniqueforthefurtherstudyofListeria.FreshbrothcultureofListeriaivanoviiwasusedasstudymaterial.Bacteriadepositwascollectedbycentrifugation，andthreelysingapproacheswereadoptedsepa?rately.Non-secretedproteinswereobtainedthroughthemethodoftrichloroaceticacid（TCA）-acetonepre?cipitationinthelysissolution，andverifiedbysodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis（SDS-PAGE）andWestern-blot.SDS-PAGEbandsofnon-secretedproteinsextractedviathemethodof1ysozyme-ultrasonication-TCA-acetoneprecipitationweredistinctandsufficient，andtheWestern-blotre?sultswerespecific.Themethodoflysozyme―ultrasonication―TCA―acetoneprecipitationcanbeusedtoex?tractListerianon-secretedproteinsefficiently，whichisqualifiedforcommonproteinexperiments，andisareliablemethodforextractingnon-secretedproteinsfromListeria.
Keywords：Listeria；protein；extraction；ultrasonication
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：029-033）
李斯特菌是一类革兰阳性无芽孢杆菌，包括单增李斯特菌U―monocytogenes，LM）、绵羊李斯特菌（Livanovii，LI）等7个菌种，具有独特的胞内增殖规律：进入胞内，逃逸胞吞泡，在细胞浆内增殖，以细胞-细胞的传播方式扩大感染细胞范围[1、2]。李斯特菌在吞噬细胞等抗原递呈细胞胞浆内增殖的生物学特点，是该菌诱导机体产生特异性T细胞免疫应答的最主要因素，也是其作为T细胞免疫应答研究工具的生物学基础[3、4]。由于李斯特菌能诱导机体特异性细胞免疫应答，使得该菌被越来越多地用于减毒活菌载体重组疫苗的构建[5-7]：在构建以李斯特菌为载体的重组疫苗研究中，重组菌蛋白质表达的验证是关键的一步.同时研究者还需了解目的蛋白是存在于菌体内还是分泌到胞外。目前发表的文献中，尚未查到成熟的、重复性好，且适用于李斯特菌菌体蛋白的提取方法。本研究采用几种方法分别提取李斯特菌菌体蛋白，然后用SDS-PAGE电泳及Westernblot进行检测，希望能为该菌的深入研究提供一种获取菌体蛋白的可靠手段。
1材料与方法
1.1菌株及培养条件
绵羊李斯特菌野生株（LI）和重组株LI-HA（能分泌表达带HA抗原标签的结核杆菌Ag85C蛋白，约43kD），单增李斯特菌重组株LM-0VA（能分泌表达带HA抗原标签的卵白蛋白，约35kD），由四川大学华西公共卫生学院卫生检验与检疫系实验室提供。所有菌株均用脑心浸液培养基（brianheartinfusion，BHI）于37℃培养。 1.2主要试剂及仪器
HA-单克隆抗体、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、预染蛋白质相对分子质量标准、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、考马斯亮蓝染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），三氯乙酸（TCA）（美国Sigma公司），β-巯基乙醇、0.1%（W/V）溴酚蓝（美国Amresco公司）、HRP化学发光底物显色反应液（美国ThermoFisher公司），PVDF膜（美国Millipore公司），超声破碎仪（美国S0N-ICS公司），低温局速离心机（美国ThermoFisher公司），TS-A型脱色摇床（江苏金坛金城国胜实验仪器厂），分光光度计（美国Unico公司），PAGE垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司），DY-CZ-40D型转移电泳槽（北京六一仪器厂），Chemi-DocXRS凝胶成像系统（美国Bio-rad公司），DYY-DI2型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），恒温气浴摇床（美国ThermoFisher公司）。
1.3主要试剂的配制
1.3.1重悬液
称取1g蔗糖和10mg溶菌酶，溶解于3.7mLddH2O，加入0.5mL0.1mol/LPBSpH7.0，滤过除菌，分装，-20℃保存。
1.3.2裂解液1
取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，6mL10%SDS溶液，加ddH2O至10mL，滤过除菌，分装，-20℃保存。
1.3.3裂解液2
取300μL1mol/LTris-HClpH8.0溶液，60μL0.5mol/LEDTApH8.0溶液，6mL10%（W/V）SDS溶液，10mg/mL蛋白酶K，加ddH2O至10mL，滤过除菌，分装，-20℃保存。
1.3.4蛋白溶解液
称取4gSDS粉末，溶解于10mL0.5mol/LTris-HClpH8.0溶液，滤过除菌，分装，-20℃保存：
1.3.52xloading buffer
加入2.5mL0.5mol/LTris-HClpH6.8、2mL甘油、4mL10%（W/V）SDS，0.5mL0.1%（W/V）溴酚蓝，用ddH20定容至10mL，分装，-20℃保存，临用时加入β-琉基乙醇至终浓度为5%。
1.3.6TBST
称取3.52gNaCl，加入4mL1mol/LTris-HClpH7.5，纯水定容至400mL，然后加入0.2mLTween-20。
1.3.7封闭液
称取1.5g脱脂奶粉，用TBST30mL溶解。
1.4细菌菌体蛋白样品提取
1.4.1溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法
将细菌接种5mLBHI肉汤，37°C200r/min摇育过夜，取500μL增菌液转移至另一支10mLBHI肉汤中，37°C200r/min摇育，以BHI肉汤为空白调零，测定细菌培养液当OD600，当OD600≈0.8时，取5mL菌液，13000r/min离心2min，弃上清，加入2mL无菌PBS，13000r/min离心2min，弃上清，加入300μL重悬液，吹打使菌体重悬，37℃水浴2h，加人300μL裂解液1，37℃水浴30min，加入500μL4℃预冷的饱和三氯乙酸（500g三氯乙酸用227mL纯水溶解），冰浴45min，4℃13000r/min离心30min，弃上清。加入已于-20℃预冷的丙酮20mL，4℃13000r/min离心10min，弃上清，加入100μL蛋白溶解液溶解沉淀，将溶液转移至EP管，加入等体积2xloading buffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。
1.4.2溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法
细菌培养和收集步骤同上，加人重悬液37℃水浴2h后，加入300μL裂解液2，37℃水浴30min，加入500μL4℃预冷的饱和三氯乙酸，后续步骤同上。
1.4.3溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法
细菌培养和收集步骤同上，加入重悬液37℃水浴2h后，加入5mL无菌水，超声波破碎菌体细胞（振幅100%，脉冲5s，停歇5s，总共脉冲4min），加入500μL4℃预冷的饱和三氯乙酸，后续步骤同上。
1.5细菌分泌蛋白样品提取
细菌接种5mLBHI肉汤，37V200r/min摇育过夜，将5mL增菌液转移至60mLBHI肉汤中，37℃200r/min摇育，以BHI肉汤为空白调零，测定细菌培养液OD600，当OD600≈1时，取40mL菌液于13000r/min离心2min，取上清液35mL置于50mL离心管中，加入3.5mL4℃预冷的饱和氯乙酸，冰浴30min后，413000r/min离心30min，弃上清，加入已-20℃预冷的丙酮20mL，4℃13000r/min离心10min，弃上清。加入100蛋白溶解液溶解沉淀，将溶液转移至EP管，加入等体积2xloadingbuffer，沸水浴煮5min，-20℃保存。
1.6SDS-PAGE检测
按试剂盒说明书配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，上样量10μL平行上样，浓缩电压80V，分离电压120V，电泳1.5h，考马斯亮蓝染色，脱色至背景清晰。
1.7Western-blot
蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离后，恒流200mA转PVDF膜1.5h，将膜于30mL封闭液中，20℃摇床上封闭1h，将膜置于30mLTBST中，20℃摇床上洗膜10min，加入用TBST稀释的HA单抗（1：5000）10mL，4℃孵育过夜，将膜置入30mLTBST中，20℃摇床上洗膜10min，重复3次，加入用TBST稀释的二抗（HRP标记羊抗鼠IgG）（1：1000）10mL20℃孵育1h，将膜置入30mLTBST中，20℃摇床上洗膜10min，重复3次，将HRP化学发光底物显色反应液滴加于膜表面，ChemiDocXRS凝胶成像系统采集图像。 2结果
2.1SDS-PAGE检测结果
图1可见，溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌体蛋白只能在小于19KD处见到一明显条带，其余位置仅可见少量极淡条带，丰度和清晰度皆不够。图2可见，溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-内酮沉淀法提取的李斯特菌菌体蛋白仅能在约35kD处见到明显条带，其余条带几乎不可见。图3可见，溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌菌体蛋白，电泳条带丰度较高，条带清晰。图4可见，TCA-丙酮沉淀法提取的李斯特菌分泌蛋白，电泳条带较清晰，丰度较高。
以上结果表明，溶菌酶-超声破壁-TCA-丙酮沉淀法提取李斯特菌菌体蛋戎史岫茸罡
2.2Western-blot检测结果
图5可见，溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA菌体蛋白在约43kD处有清晰条带，LM-OVA菌体蛋白（菌体蛋白阴性对照）及LI菌体蛋白（菌体蛋白阴性对照）均无条带。图6可见，TCA-丙酮沉淀法提取的LI-HA分泌蛋白在约43kD处有清晰条带，LM-0VA分泌蛋白（分泌蛋白阳性对照）在约35kD处有清晰条带，LI分泌蛋白（阴性对照）无条带。
3讨论
以李斯特菌为载体的重组疫苗是当前T细胞免疫疫苗的一个研究热点，对该类型疫苗免疫学价值的研究需要以重组抗原的良好表达作为前提，常用的Western-Wot法和SDS-PAGE法都建立在成功从李斯特菌中提取蛋白的基础之上。根据细菌生长曲线，当细菌处于生长对数期，即将进入稳定期（OD600≈0.8）时，此时细菌数量基本已至最大，且对外界环境因素的影响最敏感，最适于提取菌体蛋白，而当细菌完全进入稳定期后（OD600≈1.0），此时积累大量分泌蛋白，适于提取。
细菌分泌蛋白主要存在于培养物的上清液中，可以通过TCA-丙酮沉淀的方法收集。菌体蛋白的提取需要充分裂解李斯特菌，释放胞内蛋白。由于李斯特菌属于革兰阳性菌，细胞壁厚，常规方法不易破壁，故作为本研究的重点。
常用裂解细菌的方法有机械法、化学法和酶法[8]。本研究中分别采用了SDS、蛋白酶K和超声破碎结合溶菌酶的破膜方式。溶菌酶-SDS-TCA-丙酮沉淀法对李斯特菌的裂解效果不理想，蛋白释放不完全，结果中小于19kD处的条带疑似为溶菌酶（约14kD）条带；溶菌酶-SDS-蛋白酶K-TCA-丙酮沉淀法由于蛋白酶K水解作用具有高
效的酶活性和底物广谱性，对细菌所有蛋白都有降解作用，故只在约35kD处出现一条疑似蛋白酶K（约30kD）的条带。上述两种方法均不能满足分析李斯特菌菌体蛋白的要求，而经本研究证实，溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法能够有效地裂解李斯特菌，充分释放细菌细胞内蛋白并保证蛋白质完整性。
根据LM-OVA菌体蛋白与分泌蛋白West-ern-hlot结果分析可知，该种将细菌培养物先离心后再取沉淀提取菌体蛋白的方法，可有效避免细菌分泌蛋白的干扰，从而对细菌蛋白表达方式的研究具有一定的意义。
溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法具有操作简单、耗时短、成本低、不引入干扰物质等特点，能够满足对李斯特菌蛋白的SDS-PAGE和West-ern-hlot分析的要求。分析3种方法，可认为其中超声破碎起主要作用[9-12]。值得注意的是，溶菌酶-超声破碎-TCA-丙酮沉淀法中超声强度尤为重要，可根据具体的样品量和仪器进行适当调整，超声强度一般控制在略低于产生泡沫的水平。在超声破碎的过程中需要将样品置于冰上，避免超声产生的高温使蛋白质变性；并适当调整探头位置，避免产生泡沫。
本研究中的李斯特菌菌体蛋白提取方法一次可收集蛋白约100μL，足够进行多次SDS-PAGE或Westmi-blot分析。该方法易受TCA浓度的影响，故实验过程中应严格控制饱和TCA加入量为反应总体积的10%。其次，蛋白质充分释放后应保证操作全程低温，避免蛋白质变性或降解。
参考文献（References）：
[1]VAZQUEZ-BOLAND J A， KUHN M， BERCHE P， et d. Liste?ria pathogenesis and molecular virulence determinants|J]. Clinical Microbiology Reviews， 2001. 14（3）： 584-640.
[2]CAMEJO A， CARVALHO F， REIS 0， et al. The arsenal of vir?ulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle[J]. Virulence， 2011， 2（5）： 379-394.
[3]ZENEWICZ L A， SHEN H. Innate and adaptive immune re?sponses to Listeria monocytogenes： a short overviewfj]. Microbes and Infection， 2007， 9（10）： 1208-1215.
[4]GUIRNALDA P， WOOD L，PATERSON Y. Listeria monocytogenes and its products as agents for cancer immunotherapy[J]. Advances in Immunology， 2012， 113： 81 ― 118.
[5]BRUHN K W， CRAFT N， MILLER J F. Listeria as a vaccine vector[J]. Microbes and Infection， 2007， 9（10）： 1226-1235. [6]le GOUELLEC A， CHAUCHET X，POLACK B， et d. Bacterial vectors for active immunotherapy reach clinical and industrial stagesfj]. Human Vaccines & Immunother apeutics， 2012， 8（10）： 1454-1458.
[7]李文桂，陈雅棠.重组单核细胞增生性李斯特菌疫苗的研制现状[J].中国病原生物学杂志（LI Wen-gui， CHEN Ya-tang. The state of research on recombinant vaccines of Listeria mono- ytogenes[J]. Journal of Pathogen Biology）， 2013， 8（1）： 80-86.
[8]汪家政.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社（WANG Jia- zheng. Handbook of Protein Techniques[M |. Beijing： Science Press）， 2000. 21-29.
[9]张鹭，王庆忠，路福平，等.结核分枝杆菌菌体蛋白双向电泳技术的优化[J].现代生物医学进展（ZHANG Lu， WANG Qing- zhong， LU Fu―ping， et al. Optimizing of two dimensional matography technology about cytosolic protein of Mycolncteri - am tuberculosis[J]. Progress in Modern Biomedicine）， 2006， 6（10）： 8-10， 17.
[10]何永红，田晓蓓，万呼春，等.变异链球菌蛋白质提取方法研究[J].华西口腔医学杂志（HE Yong-hong， TIAN Xiao-bei， WAN Hu-chun， et al. Study on protein extraction methods for Streptococcus mutans[J]. West China Journal of Stomoatology），2009，27（1）： 100-103.
[11]李胜军，阎雪晶，王舰.单核细胞增生性李斯特菌基因 敲除菌株的构建[J].中国医科大学学报（LI Sheng-jun， YAN Xue―jing， WANG Jian. Construction of a―deletion mutant of Listeria monocytogenes[J]. Journal of China Medical Universi?ty）， 2009， 27（1）： 100-103.
[12]杨捷琳，魏黎明，顾鸣，等.食源性李斯特菌蛋白质双向电泳图谱及稳定生长期细菌蛋白质分析[J].中国卫生检验杂忐 （YANG Jie-lin， WEI Li-ming， GU Ming， et al. Two-dimen?sional electrophoresis map of Listeria monocytoge nes proteome and proteomic analysis of stationary growth phase cells[J]. （Chi-nese Journal of Health Laboratory Technology）， 2009. 19（3）： 491-494.
