摘要：通过研究Tn+人白血病Jurkat细胞中AChE的表达状况，可以分析Jurkat细胞AChE表达与Tn抗原表达水平的关系，从而为AChE用于肿瘤的预后判断或临床治疗提供实验依据。本论文利用ELISA、色度法试验在蛋白水平分析了AChE的表达状况，利用RT-PCR以及Real-timePCR试验在mRNA水平分析了AChE的表达状况结果显示：Jurkat细胞中AChE的含量及活性明显低于Tn-的白血病细胞K562，且二者又均低于正常白细胞由此认为，人白血病细胞中AChE的含量及活性低于正常细胞，AChE的表达与Tn-抗原的表达水平呈负相关，为肿瘤的临床判断提供了有力的依据.
关键词：AChE；Tn抗原；肿瘤；JurkatT
中图分类号：R730.3 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0034-05
StudyontheExpressionProfileofAChEinLeukimiaCellLineJurkatTWhichisTnAntigenPositive
SUNXu-hong1，YUXiao-feng1，LINai-kun2，DUZhen-zhen1，LIXiao-yan1，HUTao1"
（1.CollegeofBasicSciences，BinzhouMedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China；2.AffiliatedHospitalofBinzhou MedicalUniversity，Binzhou256603，Shandong，China）
Abstract：ToanalyzetherelationshipbetweentheexpressionofAChEandTnantigeninhumanleukimiacelllineJurkatTbystudyingtheexpressinglevelandactivityofacetylcholinesterase（AChE）inthesecells，whichwillprovideexperimentalevidencesaboutusingAChEtotreattumorandevaluateitsprognosis.The.studyanalyzedtheproteinactivityandcontentofAChEusingELISAandColorimetrictest，aswellasexam?inedthemRNAexpressionlevelbyRT-PCRandReal-timePCRassayinJurkatcells.TheresultsshowedthatthecontentandactivityofAChEinJurkatcells，whichwereTnantigenpositive，significantlylowerthanthatinhumanleukimiacelllineK562，whichwasTnantigennegative.Andbothofthemwerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therefore，theconclusionwasthatthecontentandactivityofAChEinhumanleukimiacellswerelowerthanthatinnormalwhitebloodcells.Therewasanegativecorrelationbe?tweentheexpressionlevelofAChEandTnantigen.Theresultswillprovidestrongsupporttodeterminetheclinicprognosisoftumor.
Keywords：AChE；Tnantigen；tumor；JurkatT
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：034～038）
乙酸胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是中枢和外周胆碱能神经系统的重要组成成分，其经典的生物学功能是在神经突触间隙灭活神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），达到终止神经冲动的目的。近年来的研究表明，AChE的表达并不局限于胆碱能神经系统，在许多非神经组织，诸入内皮细胞、上皮细胞、间皮细胞、免疫细胞、某些肿瘤细胞以及肿瘤组织，亦有不同程度的表达[1]；并与细胞间的粘附、信号传递、细胞增殖分化以及细胞凋亡有关[2]。研究发现AChE可以通过灭活丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K/AKI），活化糖原合成激酶GSK3/3（glycogensynthesiskinase-3，GSK-3）等途径抑制肿瘤细胞的增殖[3]，诱导细胞凋亡，AChE是一种新的凋亡调控因子[4]。在表达AChE的肿瘤组织中，AChE表达越高，病人预后越好；AChE甚至被认为可以单独作为肿瘤预后的重要标志[5]。抗原是一种常见的肿瘤相关抗原，其表达水平与肿瘤组织的TNM分期有关[6、7]，与肿瘤的预后有关[8]。为彻底弄清Tn+肿瘤细胞中AChE表达状况，本文以JurkatT、K562及正常人白细胞（whitebloodcell，WBC）为研究对象，采用ELISA、色度法检测AChE的蛋白含量及水解活性；并提取RNA，通过RT-PCR、Real-timePCR克隆扩增AChEcDNA，进一步确定AChEmRNA的表达水平。分析探讨AChE与Tn抗原之间的关系，进一步明确AChE在Tn+细胞中的生物学作用。
1材料与方法
1.1细胞来源
Tn+细胞JurkatT与Tn-细胞K562由薛江楠博士惠赠，本室传代保存；正常人外周血WBC作为正常对照。 1.2主要试剂
人外周血白细胞分离液（Solarbio公司，中国）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术公司）；人乙酰胆碱酯酶ELISA试剂盒（K&D，北京奇松生物科技有限公司）；anti-TnIgMMcAb为巨同忠博士惠赠（SantaCruz公司，美国）；羊抗鼠lgM-FITC（SantaCruz公司，美国）。
1.3仪器设备
倒置显微镜IX-70（日本Olympus公司）；生物安全柜（上海力康公司）；冷冻离心机（ST16R，美国赛默飞世尔科技公司）；漩涡混合器（VWR230，美国VWR公司）；全波长酶标仪（TecanM1000，瑞士帝肯公司）；Real-timePCR仪（Rotor-Gene-3000，澳大利亚Corbett公司）；FACSCalibur流式细胞仪（BectonDickinson公司，美国）。
1.4Tn+、Tn-细胞培养和正常人白细胞分离
人类T淋巴瘤细胞系JurkatT和慢性髓原白血病细胞株K562于含10%FBS的RPMI1640（Hyclone）培养，37°C5%CO2培养72h，直接收集备用。正常人5mL肝素抗凝血，按人外周血门细胞分离液试剂说明分离白细胞，使用时用PBS悬起。
1.5超声提总蛋白
收集3种细胞悬液，离心、弃上清，重悬于2mL预冷的TBS缓冲液中，1200r/min，4℃离心10min；弃上清，冰浴上加入TBS缓冲液1mL、蛋白酶抑制剂10pL；超声时间2min，停1min，5个循环，700g，4℃离心10min；吸取上清于EP管内，加入0.5%TritonX-100，冰浴30min；按BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测样品的总蛋白浓度。
1.6AChE活性测定
利用乙酰胆碱酯酶催化硫代底物出现显色反应来测定AChE活性。96孔板，每孔加入0.1tnol/LPBS50μL，超声提取的蛋白样品10μL、10mmol/LS-AchI30μL，充分混匀，放入37℃培养箱内孵育5min或15min；加入1mol/LHC110μL，震荡混匀，终止反应；10min后加0.03%DTNB200μL，总体积300μL，震荡混匀；5min后酶标仪上405nm波长处测0D值；15min后405nm测OD值，15minOD值减去5min0D值，求得□A；根据公式AChE（U/mL）=AA/minx0.3/（13.6x0.01x1），再除以相应蛋白浓度，求出AChE活性。
1.7ELISA测AChE蛋白表达量
应用双抗体夹心法，具体步骤按照ELISA试剂盒（R&D）说明书进行操作。
1.8总RNA提取
按照Trizol试剂盒（Invitrogen）提取细胞总RNA，-80℃保存备用。
1.9RT-PCR1.9.1引物设计
根据NCBI数据库检索AChE、GAPDH基因的cDNA序列，用PrimerExpress2.0软件设计，由上海硕世生物科技有限公司合成（表1）。
1.9.2cDNA合成与PCR反应
逆转录体系20m-L：TotalRNA1|j.g，Oligo（dt）Primer（2.5μmol/L）1μL，RNaseFreewater适量，定量至总体积13μL。65°C，10min，立即置于冰上，静置2min，加入5xRTBuffer4μL，dNTPMix-ture（各10mmol/L）2μL，RNaseInhibitor（40U/μL）0.5μL，ReverTraAce（20U/（μL）0.5μL。55℃孵育30min，85℃加热5min，-20℃保存备用。PCR反应体系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，DD Water7μL；PCR反应条件：95℃预变性3min；30x（95℃，30s；57°C，30s；72°C，30s），72℃延伸1min。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测分析。
1.10 Real-timePCR
1.10.1引物设计
引物序列用PrimerExpress2.0软件设计，由上海硕世生物科技有限公司合成（表2）
1.10.2基因水平的定量检测
采用FAM荧光探针法，GAPDH作为内参，Real-timePCR反应体系20μL：qPCRMasterMix（2x）10μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，荧光探针（10μmol/L）0.5μL，cDNA模板1-2μL，DDWater加至20μL，每一样品做3个复孔；Real-timePCR反应条件：40x（95℃，5min；95℃，10s，55°C，40s，72℃，1min）。
1.11 统计学处理
本文中的所有数据均应用SPSS统计软件作统计学处理，多组间两两比较采用Krnskal-WallisH检验，P
2结果
2.1Tn抗原的表达状况
流式细胞仪检测结果显示，白血病细胞系JurkatT表达Tn抗原（图1A）；白血病细胞K562与正常WBC不表达Tn抗原（图1B、C）。
2.2AChE在蛋白水平的表达分析
Tn+细胞（JurkatT）AChE活性与Tn-细胞（K562，正常对照WBC）相比，活性明显下降；Tn-细胞之间，即K562与正常WBC的AChE活性相比，K562明显低于正常WBC（n=5，P
采用RT-PCR、Real-timePCR方法，以GAPDH为内参，比较JurkatT、K562和WBC目的基因的相对mRNA的表达水平（见图3A、B），结果显示：JurkatT细胞AChEmRNA水平明显低于K562和WBC；K562与正常WBC相比，K562AChEmRNA水平低于正常WBC。
3讨论
AChE是催化水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸，恢复突触后膜极化的酶，在传递神经冲动的过程中起重要作用。近期研究发现AChE不仅局限于中枢和外周神经系统，在一些非神经组织和器官，如上皮组织、血细胞等中也有存在[9]。更值得注意的是，AChE的表达异常与多种肿瘤的发生、发展及预后有关。包括神经系统肿瘤例如星形胶质细胞瘤[10]和非神经系统的肿瘤，如乳腺癌[11]、肝癌[3]、结肠癌等。Tn抗原是肿瘤相关抗原，人类70%～80%的癌症组织，包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌均可检测到Tn抗原的表达，并且Tn抗原的表达与肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关[12]。
尽管已在多种类型的肿瘤细胞中发现了AChE的表达水平较正常细胞偏低[13、14]，但是在Tn+的肿瘤细胞中AChE的表达水平如何未见报道我们分别从基因及蛋白水平研究AChE在正常白细胞及白血病细胞的表达状况。发现白血病细胞JurkatT及K562中AChE的活性及含量均低于正常白细胞，而JurkatT细胞中AChE的活性及含量明显低于K562细胞。更值得注意的是JurkatT细胞表达Tn抗原，但K562细胞不表达Tn抗原。
总之，我们首次提出在人白血病细胞中AChE的表达及活性与Tn抗原的表达成负相关。目前研究认为肿瘤细胞中Cosmc基因异常导致T-synthase折叠错误，糖基化途径异常致Tn抗原的表达AChE基因位于人类7号染色体上（7q22），白血病、卵巢癌和乳腺癌AChE7q22染色体缺失，骨髓增生异常综合征、急性髓样白血病AChE基因拷贝数量改变，肺癌组织中AChE糖基化异常。AChE经过连接糖基化、适当折叠盘曲才能形成有活性的AChE，缺乏糖基化修饰的AChE活性下降臣多在内质网降解；AChK3个糖基化位点上（AChETN296Q、AChh：TN381Q、AChETN495Q）任一位点的突变体及3个位点同时突变的突变体（A-ChETN296Q/N381Q/N495Q）转染目的细胞，AChE活性有不同程度的下降，AChETN381Q、AChE-TN296Q/N381Q/N495Q尤为明显[16、17]。因此AChE基因转录水平及转录后修饰的异常可能是影响AChE表达的主要原因：这与我们发现的膜糖蛋白糖基化异常导致肿瘤细胞表达Tn抗原，似乎存在某种关联与Tn-肿瘤细胞相比，Tn+的肿瘤细胞中AChE的基因是否有异常，Tn+的肿瘤细胞中AChE对肿瘤细胞的增殖及凋亡的影响如何还有待进一步研究。
4展望
我们研究发现在白血病细胞中，AChE的表达与Tn抗原的表达呈负相关。有研究表明，虽然在结肠癌细胞中AChE的表达量较正常细胞低，但在不表达Tn抗原的结肠癌细胞系Caco-2中AChE过表达。提示可能在结肠癌细胞中Tn抗原的表达与AChE的表达也存在负性相关的关系：有关Tn抗原及AChE在肿瘤细胞中异常表达的机制研究均有相关报道。但在Tn+的肿瘤细胞中，AChE表达量及活性降低的机制尚不清楚，可能Tn抗原的表达影响了AChE的代谢和信号转导的相关蛋白。在其他Tn+的肿瘤细胞及组织中是否也存在AChE的表达异常仍待深人研究明确Tn抗原与AChE在肿瘤细胞中表达之间的关系，有助于全面了解AChE及Tn抗原的生物学功能，认清Tn抗原及AChE异常表达的病理学意义，为肿瘤的诊断、治疗及预后提供新的实验依据，为以Tn抗原或AChE为靶点治疗肿瘤制定新策略。
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