关键词：豌豆；瞬时表达；发芽种子；真空侵染
中图分类号：Q819
文献标识码：A
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1质粒、菌株、抗体及植物材料
实验过程中所用抗生素利福平、卡那霉素、四环素及乙酰丁香酮均购自北京鼎国生物技术有限公司，DNA2000 Marker、蛋白质低分子质量Marker购自日本TakaRa公司，蛋白质杂交所用二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG，购自北京中山生物技术有限公司。
用来鉴定豌豆早褐病毒载体pCAPE2-GFP的引物为：5'-CGGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAACTT-TT-3'5'-GGGGTACCTTATTTGTATAGTTCATCCATG-C-3'
用来鉴定pCAPEl载体的引物为：5'-CGTTAGATTGCGCTGTGG-3'5'-TGCCTTTGCTACGAACCT-3'
以上引物由上海生物工程有限公司合成。
分别以豌豆早褐病毒载体pCAPE2-GFP和pCAPEl为模板进行PCR鉴定，PCR反应条件为94℃预变性3min； 94℃50s，50℃ 50s.72℃50s，33个循环；72℃ 8min。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。
本研究选择真空处理时间、菌体工作液浓度及真空压力3个因子对该体系进行优化，实验过程中以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表达率（表达绿色荧光蛋白的植株占总株数的比率）来评价该体系的工作效率，实验设置3次重复，每次处理种子数目不少于20粒，结果取平均值。
在真空压力（0.08MPa）和菌体工作液浓度（OD00=1.0～1.5）恒定的条件下选择真空处理时间分别为：1、10、15min对豌豆种子进行真空侵染，侵染后播种于土壤中，幼苗出土后紫外灯下跟踪绿色荧光蛋白的表达情况并记录。
选择相同的菌体工作液浓度，分别采用叶片注射法及发芽种子真空侵染法进行接种，紫外灯下跟踪观察GFP的表达情况并拍照记录。在外源蛋白表达高峰期分别收集可溶性总蛋白，15%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳后转膜，并以Rubisco大亚基作为内参，以GFP抗体检测外源蛋白质的表达情况。
2.2实验结果
2.2.1豌豆早褐病毒载体的PCR鉴定结果
豌豆早褐病毒的两个载体同时接种植物才能完成正常的侵染工作，通过PCR法对pCAPE2-GFP载体上的GFP基因片段和pCAPEI上的特异片段进行鉴定，实验结果呈阳性，结果如图1所示。
2.2.2发芽种子真空侵染体系的优化
2.2.3发芽种子真空侵染法与叶片注射法的比较
12～15d时提取豌豆植物可溶性总蛋白，以Rubisco大亚基作为内参通过蛋白杂交法比较两种接种方法外源蛋白的表达量，实验结果如图4所示，Rubisco大亚基杂交结果表明各泳道（5～7）植物蛋白质上样量基本一致，GFP杂交结果表明两种接种方法外源蛋白的表达量相当。
3讨论
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