4.江西中医药大学生物化学教研室，南昌 330004）
关键词：斑马鱼（Danio rerio）;血清淀粉样蛋白A;原核表达;抗体制备;菌结合
Prokaryotic Expression， Antibody Preparation and Bacteria Combining of
SAA Protein in Zebrafish
4.Department of Biochemistry Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）
Key words： zebrafish（Danio rerio）; SAA; prokaryotic expression; antibody preparation; bacteria combining
1 材料与方法
1.1 试验材料
使用Primer premier 5.0软件设计上、下游引物，以pGEM-T-SAA为模板进行PCR扩增，其中上游引物序列：5′-TTTGAATTCATGAAGCTTCTTCTTG -3′，下游引物序列：5′-TTTTCTAGATATGGGCAGG
1.4 斑马鱼SAA蛋白的菌结合试验
将获得的斑马鱼SAA纯化蛋白用于细菌结合试验，具体操作见文献[10]。
1.5 斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清制备
取100 μg纯化的斑马鱼SAA融合蛋白进行SDS-PAGE，切下目的蛋白质条带，以去离子水反复漂洗，去除凝胶上的甲醇和冰醋酸，以pH 7.4的PBS缓冲液4 ℃浸泡过夜。于冰浴中用研钵研磨直至悬浮液中的凝胶颗粒细小而均匀，加入等体积的弗氏佐剂，继续研磨或用注射器反复抽打使完全乳化。将1 mL用弗氏完全佐剂乳化的抗原溶液通过腹腔注射接种发育良好的纯种Balb/c小鼠体内做为基础免疫，基础免疫后14 d进行加强免疫。注射间隔周期为7 d，加强注射所用的抗原溶液用弗氏不完全佐剂进行乳化。加强免疫4次后采用传统摘除眼球取血法采集Blab/c小鼠血液。取出的血液37 ℃保温1 h后，4 ℃静置过夜，5 000 r/min离心10 min后，取上清-80 ℃分装保存。
1.6 斑马鱼SAA蛋白抗鼠血清效价的测定
2 结果与分析
2.2 SAA蛋白的表达与纯化
2.3 斑马鱼SAA蛋白菌结合试验结果
2.4 斑马鱼SAA抗小鼠多克隆抗体效价的测定结果
3 小结与讨论
斑马鱼SAA蛋白具有广谱的菌结合能力，对本试验所选取的5种细菌均表现出很强的吸附能力。哺乳动物SAA蛋白一般只能对革兰氏阴性菌有结合能力，对革兰氏阳性菌无结合能力。哺乳动物的免疫系统比鱼类复杂得多，对不同种类的细菌表现出不同的免疫机制。斑马鱼属于进化地位较低等脊椎动物，SAA蛋白可能担负起对整个细菌的识别，而在哺乳动物中，SAA蛋白功能可能被弱化和部分分离，进化压力胁迫对SAA蛋白功能产生了较大的影响。
参考文献：
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