摘要：HMA蛋白（heavy metal transporting ATPase）是一种在植物中广泛存在的多功能蛋白。根据滇龙胆转录组GrHMA基因序列，设计特异性引物，通过RT-PCR扩增GrHMA基因序列，并进行TA克隆、测序及序列分析；构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrHMA，转入E.coli Rosetta（DE3）中，并在37℃、1.Ommol/L IPTG下成功诱导表达。序列分析表明，GrHMA基因是HMA超家族的成员；GrHMA氨基酸序列系统发育分析表明，CrHMA与TcHMA处于同一进化枝。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。这些结果为GrHMA蛋白的进一步纯化及结构和功能的研究奠定基础。
关键词：滇龙胆；GrHMA基因；克隆；原核表达
中图分类号：Q786
文献标识码：A
虽然HMA蛋白在植物中广泛分布，但目前的研究仍仅局限于拟南芥，在重金属超富集植物中没有进行系统全面的研究，而在药用植物滇龙胆中至今未有报道。本研究根据3年生滇龙胆的转录组中GrHMA基因序列设计特异性引物，从滇龙胆幼叶中提取RNA，反转录为cDNA，进而扩增到GrHMA基因序列，并进行TA克隆、测序和序列分析；构建GrHMA基因原核表达载体，在大肠杆菌Rosetta中进行表达，使用SDS-PAGE检测其蛋白表达情况。结果显示GrHMA基因为HMA基因家族的成员，在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导下成功表达，这将为滇龙胆GrHMA蛋白的纯化、结构和功能研究奠定基础，也为植物、动物、微生物中HMA的研究提供参考。
1材料与方法
1.1植物材料
工程菌E.coli Trans 5α、E.coli Rosetta（DE3）、RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue Reagent、反转录试剂盒、限制性内切酶BamH I和Xho I及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、X-gal等均购买于宝生物工程（大连）有限公司；高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）、多功能DNA纯化回收试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；质粒pGEX-4T-l由玉溪师范学院分子生物学实验室保存；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。 1.3引物设计
根据3年生滇龙胆转录组中GrHMA基因序列和原核表达载体pGEX-4T-l多克隆酶切位点，设计一对特异引物GrHMABamH I-F：5'一GG -ATCCATGTCTATGGTGGAAGTTTTGG-3'：GrHMAXho I -R： 5'-CTCGAGTCACATAATAGAACAAG-CATGGG-3'。
1.4滇龙胆叶片总RNA的提取及GrHMA基因的扩增
1.5GrHMA的生物信息学分析
利用NCBI网站上的BLAST程序对GrHMA蛋白进行分析，应用DNAMAN推测并比对氨基酸序列，利用在线软件预测GrHMA蛋白的相对分子质量、氨基酸含量、等电点、二级结构、三级结构和稀有密码子等；应用软件Mega4.0构建系统进化树。
1.6pGEX-4T-1-GrHMA重组质粒在大肠杆菌Rosetta中的表达
2结果与分析
2.1滇龙胆GrHMA基因的克隆与分析
以滇龙胆cDNA为模板扩增出的PCR结果表明，扩增片段在500bp附近，是预期的目的片段（图2）。pMD19T-GrHMA经酶切验证连接正确，有明显的、单一的目的条带，且目的条带与预期条带的大小吻合。
通过使用ExPASy ProtParam tool对GrHMA蛋白的氨基酸含量进行预测，结果显示GrHMA蛋白含有20种氨基酸，其中丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）的含量最高，为10.6%，其次是甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser），为7.7%；谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）含量最低，仅为0.7%。
GrHMA氨基酸序列与NCBI中经比对后一致性较高的可可（Theobroma cacao）、拟南芥（Ara-bidopsis thaliana）、蓖麻（Ricinus communis）、蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）HMA氨基酸序列进行比对，结果表明GrHMA蛋白与可可TcHMA同源性最高（74%），其次是拟南芥AtHMA，同源性为70%，与蒺藜状苜蓿HMA蛋白的同源性较低（39%），见表1。
根据推测的氨基酸序列进行的系统发育分析，结果表明GrHMA与TcHMA在同一进化枝上，表明GrHMA与TcHMA蛋白的亲缘关系较近（图5）。GrHMA与NCBI中HMA已知序列进行多序列比对，结果表明滇龙胆GrHMA蛋白保守性较强，与已知序列存在较高的同源性（图6）。
利用ExPASy SignalP 4.0 Server在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对GrHMA蛋白进行分析，未发现信号肽，表明GrHMA不是分泌蛋白。
利用在线软件Expasy中的TMHMM工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测GrHMA蛋白的跨膜螺旋区，结果表明GrHMA蛋白不是膜蛋白，无跨膜螺旋区。
利用CPHmodels 3.2 Server在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）预测GrHMA蛋白的三级结构（图7），从图中可以看到GrHMA的三级结构形成了多个无规则卷曲，整个三维结构呈“口袋”状，表明该蛋白可能通过该“口袋”与金属离子和DNA结合。
用ProtFun在线软件基于已知的具有相似功能蛋白的搜索和比对，对GrHMA编码的蛋白质进行功能预测，结果显示GrHMA蛋白参与复制与转录、能量代谢、翻译、转录调控的可能性远高于其他功能，其可能性分别为0.204、0.184、0.167和0.118；另外其参与金属离子转运的可能性为0.009，这些数据能为GrHMA蛋白的后续研究提供参考。
2.2原核表达重组质粒的鉴定
利用BamH I和Xho I双酶切pGEX-4T-l一GrHMA重组质粒，可检测到约429bp的片段（图8），表明GrHMA基因已插入pGEX-4T-1载体中。对pGEX-4T-1-GrHMA重组质粒进行测序，结果显示连入原核表达载体中的基因片段与目的序列一致，酶切位点处序列连接无误，没有移码及碱基突变等现象出现，表明已获得正确的CrHMA原核表达载体。
2.3 SDS-PAGE分析
3讨论
本研究首次从滇龙胆中克隆到GrHMA基因，成功将其连接到pGEX-4T-l原核表达载体上并顺利在大肠杆菌表达菌Rosetta（DE3）中表达到目的蛋白。大肠杆菌中外源目的基因能否顺利表达及表达效率的高低取决于原核表达载体、大肠杆菌菌株、诱导温度、诱导时间以及诱导剂浓度等。本研究在大肠杆菌Rosetta中进行表达，获得预期效果，在37℃、60r/min、IPTG终浓度为1mmol/L时，成功诱导了目的蛋白的表达。 本研究克隆了滇龙胆GrHMA基因，成功在大肠杆菌Rosetta中表达并获得融合蛋白。这为GrHMA蛋白结构和功能的深入研究以及进一步开发和利用植物HMA蛋白都具有重要的理论和应用价值。
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