摘要：从前期建立的蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]根转录本数据库中克隆得到1个编码DREB类转录因子基因。结果表明，AmDREB2.2基因序列全长1 045 bp，开放阅读框（ORF）为597 bp，编码198个氨基酸，具有典型的DREB转录因子保守的AP2结构域。实时荧光定量PCR分析表明，该基因能在根、叶中表达，但对干旱、低温响应不同，AmDREB2.2主要参与根的干旱胁迫应答。在AmDREB2.2基因的编码区两端分别加入BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点，双酶切植物表达载体pPZP212和带有酶切位点的AmDREB2.2基因PCR产物，成功获得了AmDREB2.2的植物过表达载体pPZP212-AmDREB2.2。
关键词：蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]；AmDREB2.2基因；表达特征；植物表达载体
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）16-4065-05
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.061
Cloning of AmDREB2.2 Gene of Ammopiptanthus mongolicus and Construction of Its Plant Expression Vector
ZHANG Zhi-wei， LI Zhang-lei， GAO Fei， CAO Yu-zhen， XIA Bo-lin， ZHOU Yi-jun
（College of Life and Environmental Sciences， Minzu University of China， Beijing 100081， China）
Abstract： A new dehydration responsive element binding protein（DREB） transcription factor gene， which was named as AmDREB2.2， was cloned from Ammopiptanthus mongolicus （Masxim.） （cheng f.） root transcriptome database. The full length of the AmDREB2.2 cDNA was 1 045 bp， including a single 597 bp opening reading frame which encoded a 198-amino acid peptide with a conserved AP2 domain. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the AmDREB2.2 expressed in leaf and root of A. mongolicus，but there were different expression patterns under drought or low temperature stress respectively， and it could be mainly induced by drought in root. The plant expression vector pPZP212 and AmDREB2.2 with BamH I and Sac I site were digested by these two restriction enzymes， were ligated and recombinant， and then plant expression vector pPZP212-AmDREB2.2 was successfully constructed.
Key words： Ammopiptanthus mongolicus； AmDREB2.2 gene； sequence analysis； expression pattern； plant expression vector
植物中应答逆境胁迫的基因通常按照功能分为两类，一类是功能基因；另一类是调控基因。转录因子基因作为调控基因的一种，可以与真核基因启动子的顺式作用元件结合，从而达到激活或者抑制转录的目的[1，2]。目前，已经获得了多种转录因子基因，将其应用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要进展[3，4]。其中，对DREB（Dehydration responsive element binding）转录因子基因的研究较多[5-7]。DREB转录因子属于AP2/EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）家族成员，受干旱、高盐或低温诱导表达，其氨基酸序列的N末端具有核定位信号，C末端具有转录激活结构域，而位于中部的AP2/EREBP结构域非常保守，由58个氨基酸组成，能形成3个β-折叠和1个α-螺旋，两个结构都可以结合到DRE元件的核心结构PUCCGAC上[3，8]。研究表明，DREB2转录因子基因主要参与调控植物应答干旱、高盐和热激胁迫的基因表达[3，9]。
蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]隶属豆科沙冬青属，为中亚荒漠中的孑遗植物，具有极强的耐旱、耐低温、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科学价值和生态价值于一身的研究材料。近年来，关于蒙古沙冬青的抗逆机理和抗逆基因资源的挖掘受到关注，并取得了重要研究进展[10-14]。本研究以蒙古沙冬青为研究材料，基于实验室前期建立的蒙古沙冬青根转录本数据库[10]，克隆获得1个新的DREB类转录因子基因，对其结构和逆境表达模式进行了分析，并构建了AmDREB2.2基因的植物表达载体，为进一步通过异源表达验证AmDREB2.2基因的生物学功能奠定了基础。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 蒙古沙冬青种子采自于宁夏回族自治区中卫县。
1.1.2 菌株和质粒 pPZP212植物表达载体由中央民族大学生命与环境科学学院植物分子生物学实验室保存、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α购自北京博迈德科技发展有限公司、pGEM-T载体购自Promega公司。
1.1.3 酶和试剂 Trizol试剂购自Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一链合成试剂盒和PCR Master Mix购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；SYBR Green Supermix和限制性内切酶均购自Thermo公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据蒙古沙冬青根转录本数据库中获得的DREB相关基因序列，采用Primer 5.0设计引物，引物P2.2F-A：5′-GCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′；P2.2R-A：5′-TCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′扩增目标基因。
根据荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测引物的设计原则，设计基因检测引物和内参引物。引物P2.2F-B：5′-CTGGGGTAGGCACAGAAGAG -3′；P2.2R-B：5′-GCCCAAAACCAGGAAGAAAT-3′扩增目标基因AmDREB2.2片段。用引物PAmeIF1-F：5′-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3′；PAmeIF1-R：5′-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3′扩增内参基因AmeIF1。
根据植物表达载体和目标基因的结构特点设计引物，引入BamH Ⅰ 酶切位点，下游加入Sac Ⅰ酶切位点。引物序列为P2.2F-C：5′- CGCGGATCCGCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′（划线部分为BamHⅠ酶切位点）；P2.2R-C：5′-CGCGAGCTCTCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′（划线部分为SacⅠ酶切位点）。
1.2.2 材料培养与处理 种子萌发培养4周后，用含20% PEG 6 000的1/2 Hoagland营养液浇灌，分别处理1、6、24、72 h，然后4 ℃下分别处理1、3、6、24 h。以未胁迫处理（0 h）为对照，分别取胁迫处理和未经胁迫处理后的植物根和叶片组织，称量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表达模式分析。
1.2.3 AmDREB2.2基因的克隆 采用改良的Trizol 法分别提取不同胁迫处理的植物根和叶片组织总RNA[15]，用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA第一链。
以反转录得到的未经胁迫处理的cDNA为模板，以P2.2F-A和P2.2R-A为引物进行PCR扩增目标基因，PCR反应体系（40 μL）：2×Pfu PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。胶回收目的片段，与pGEM-T载体连接，转化E. coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR检测，筛选出阳性克隆，送至北京华大基因研究中心测序。
1.2.4 AmDREB2.2基因的生物信息学分析 分别采用相关生物信息学软件对获得的蒙古沙冬青编码DREB基因AmDREB2.2及演绎的氨基酸序列进行分析，具体分析目标及选用的相关软件见表1。
1.2.5 AmDREB2.2的表达模式分析 采用qRT-PCR对不同胁迫处理下AmDREB2.2在根和叶片中的表达模式进行分析，以未处理（0 h）为对照，以AmeIF1为内参基因。PCR反应体系（10 μL）：2×SYBR Green Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，稀释后cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.6 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，循环40次；55 ℃退火10 s（0.5 ℃/循环），循环81次。采用基因表达相对定量分析，将对照样本的基因表达量设为1，处理样本中的基因表达量变化的倍数用2-△△Ct来表示，其中，△△Ct=△Ct（处理）-△Ct（对照），△Ct=Ct（目标基因）-Ct（内参基因），计算在不同处理下基因的表达量，其中每个处理重复3次，每个重复做3个平行。
1.2.6 AmDREB2.2的表达载体构建与鉴定
1）含酶切位点AmDREB2.2基因的扩增。以反转录得到的未胁迫处理的cDNA为模板，以P2.2F-C和P2.2R-C为引物进行PCR扩增，反应体系（40 μL）：2×Taq PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共38个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。胶回收含酶切位点的AmDREB2.2基因，与pGEM-T载体连接，转化E. coli DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR检测，筛选出阳性克隆，送至北京华大基因研究中心测序。
2）AmDREB2.2表达载体构建与鉴定。以pPZP212作为植物表达载体。以BamHⅠ和SacⅠ双酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T载体和pPZP212表达载体，分别胶纯化回收目的片段，将两个目的片段进行连接，转化E. coli DH5α，在含有壮观霉素的LB固体培养基上筛选转化菌落。提取质粒，用BamHⅠ和SacⅠ进行单酶切和双酶切验证。 2 结果与分析
2.1 AmDREB2.2基因全长的克隆
用改良Trizol法提取蒙古沙冬青总RNA，根据蒙古沙冬青根的转录本数据库中搜索获得的DREB基因序列设计引物，进行PCR扩增，获得的目的片段大小为600 bp左右，扩增结果与预测结果一致（图1）。
2.2 AmDREB2.2基因的生物信息学分析
采用DNAMAN 7.0分析获得的AmDREB2.2基因全长序列，序列全长为1 045 bp，其中5′ UTR 长度为204 bp，3′ UTR长度为244 bp。ORF编码区长度为597 bp，可编码198个氨基酸，其等电点（pI）为8.63，分子质量为21 141.54 u。采用NCBI在线分析序列表明，此基因编码的蛋白质具有典型的AP2结构域，具有11个DNA结合位点，应属于AP2超家族成员（图2A）。
二级结构预测表明AmDREB2.1的二级结构主要有3种类型组成：α-螺旋、β-折叠片和无规则卷曲，3种结构所占比例不同，以无规则卷曲为主，β-折叠片较少（图2B）。
用SignalP 3.0 Server在线软件分析确定AmDREB2.2不具有信号肽。用PSORT对AmDREB2.2的氨基酸序列进行亚细胞定位分析，推测其定位于细胞核中。采用cNLS Mapper对AmDREB2.2的氨基酸序列进行核定位信号分析，确定其核定位信号序列由27个氨基酸构成。
2.3 AmDREB2.2的系统进化分析
将AmDREB2.2氨基酸序列与相近的12个编码DREB氨基酸序列进行比对并构建进化树。结果表明，各序列尽管长短有别，但都具有12个保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能与AP2结构域有关（图3A）。从构建的系统进化树可知，在选取的13种DREB蛋白质中，AmDREB2.2与白刺花（Sophora davidii）SdDREB2/AFP89590.1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C，水稻（Oryza sativa）OsDREB2A/Q0JQF7.1和玉米（Zea mays）ZmDREB2A/ANP_001105876.1聚为一类，其中与SdDREB2最近；与大豆（Glycine max）GmDREB1/AAP47161.1、GmDREB2/ABB36645.1和GmDREB3/ABB36646.1、盐豆木（Halimodendron halodendron）HhDREB2/ACJ66376.1以及已有文献报道的2个蒙古沙冬青中编码DREB序列AmDREB1[16]和AmDREB3[17]关系较远（图3B）。
2.4 AmDREB2.2的表达模式分析
2.4.1 干旱胁迫下AmDREB2.1的表达特征 以20% PEG 6 000模拟干旱胁迫处理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在干旱胁迫下不同组织中的响应特点，结果见图4A。AmDREB2.2在根和叶片中的逆境表达模式不同，在不同干旱胁迫处理下根中AmDREB2.2表现为迅速上调表达，其中1 h表达量为对照水平的7.84倍，6 h表达量达到最大值，为对照水平的13.45倍；随着胁迫时间延长，24、72 h表达量呈明显的回落趋势，与对照基本相同。而叶中AmDREB2.2在不同干旱胁迫条件下表现为下调表达，24 h表达量显著下调，为对照水平的0.26；随着胁迫时间延长，表达量有上升趋势。
2.4.2 低温胁迫下AmDREB2.2的表达特征 以4 ℃进行处理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在低温胁迫下的响应特点，结果见图4B。AmDREB2.2在根和叶片中的逆境表达模式相似，与对照相比均表现为下调表达，但未达到显著水平。
2.5 AmDREB2.2表达载体的构建
以BamHⅠ和SacⅠ双酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T载体和pPZP212表达载体，分别胶纯化回收目的片段。将两个目的片段进行连接，获得重组载体pPZP212-AmDREB2.2，转化E. coli DH5α菌株，并在含有抗生素壮观霉素的LB固体培养基上筛选转化菌落。以P2.2F-C和P2.2R-C为上、下游引物，以含有重组载体pPZP212-AmDREB2.2的菌液为模板，扩增得到约600 bp的AmDREB2.2特异条带（图5A）。从两个单克隆1和3的菌液中提取质粒进行双酶切鉴定，结果见图5B。图中5B为双酶切产物，大片段长度约为10 kb，小片段大小约为600 bp；2和3分别为BamHⅠ和SacⅠ的单酶切产物，大小约为10 000 bp；4和5为重组质粒，表明AmDREB2.2表达载体构建成功。
3 小结与讨论
植物中的DREB类转录因子成员较多，参与不同的逆境胁迫应答，如在拟南芥中，DREB1基因主要受低温诱导表达，DREB2基因则受干旱、高盐和高温诱导表达[1]。蒙古沙冬青为主要生长于中亚荒漠地区惟一的常绿阔叶灌木，具有极强的耐干旱、耐低温、耐贫瘠、耐受沙埋等特性。本研究从蒙古沙冬青中获得了1个编码DREB类转录因子基因AmDREB2.2，生物信息学分析表明其编码蛋白具有典型的DREB 类转录因子所共有的保守AP2结构域和保守的氨基酸序列。系统进化分析表明，AmDREB2.2与同为豆科的白刺花SdDREB2亲缘关系最近，但与同为豆科的盐豆木HhDREB2、大豆GmDREB1和GmDREB2以及已经报道的蒙古沙冬青AmDREB1[16]和AmDREB3[17]分属在不同的进化支上，同科植物以及同种植物不同成员之间的进化关系分析结果提示，这些成员可能存在功能上的差异。
Li等[18]研究了大豆GmDREB不同成员的表达特征发现GmDREBc仅在根中受盐、干旱和ABA诱导。本研究结果表明，AmDREB2.2在蒙古沙冬青的根和叶片中均能表达，但在不同胁迫条件下，AmDREB2.2在根与叶片的表达模式不同。AmDREB2.2主要在根中受干旱胁迫的强烈诱导，而不受低温胁迫诱导，表明AmDREB2.2主要参与蒙古沙冬青应答干旱胁迫的反应，且具有组织特异性，仅在根中积极响应，符合DREB2类基因主要受干旱、高盐和高温诱导表达的特征。 植物的抗逆性是一个受多基因控制的数量性状，转化单一下游耐逆基因仅能在一定程度上提高植物的抗性，存在一定的局限性。而通过超表达转录因子可以激活更多的下游靶基因获得抗逆性，故而被认为是植物抗性基因工程的首选基因。本研究选择花椰菜花叶病毒（CaMV）35S作为启动子的pPZP212表达载体，成功构建了重组表达载体pPZP212-AmDREB2.2，为进行异源表达验证基因功能以及植物抗性基因工程研究奠定了基础。
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