摘要：以前期获得的银杏（Ginkgo biloba L.）MECT基因的cDNA序列为模板，通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到GbMECT翻译起始位点上游982 bp的启动子序列，研究银杏MECT基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明，该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件，主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件TGTCA序列、抗损伤应答元件ERF3和热激响应元件HSE等。此外，在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件，充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。
关键词：银杏（Ginkgo biloba L.）；染色体步移；2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶基因；调控元件
中图分类号：S792.95 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1746-05
在银杏（Ginkgo biloba L.）萜内酯合成的MEP途径中，MECT （2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate Cytidyltransferase，MEP cytidyltransferase）是其第三步反应的催化酶，催化2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-ohosphate， MEP）形成4-（胞苷5-焦磷酸）-2C-甲基赤藓糖[4-（cytidine 5-diphospho）-2C-methyl-D-erythritol，CDP-ME]，并最终形成合成萜内酯的前体物质，因此MECT是调控萜类物质合成的一个关键酶。目前，已经从银杏（Ginkgo biloba.L）[1]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[2]、玉米（Zea mays）[3]、番茄（Lycopersicon esculentum）[4]、水稻（Oryza sativa）[5]、大豆（Glycine max）[6]、火炬松（Pinus taeda）[7]等多种植物中克隆了MECT基因。
研究发现，在DNA水平上，银杏MECT基因与拟南芥和水稻MECT基因相似度分别达到了70.7%和70.2%。尽管已从多种植物中获得MECT基因的cDNA序列，但目前关于该基因启动子表达调控方面的研究报道较少，尤其缺乏对该基因启动子的基本结构和功能分析方面的探究，本试验通过染色体步移法克隆银杏MECT基因的启动子，初步分析该启动子所含的调节元件和作用特点，旨在为启动子下一步的功能分析提供可靠依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
银杏幼叶采自黄冈师范学院银杏苗圃园，品种为家佛手14年生实生苗。采后自封袋封装，于-80 ℃冰箱中冷冻保存。试验所用大肠杆菌（Escherichia coli）菌株Top10为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。
1.2 试验试剂
各种限制性内切酶、ExTaq DNA聚合酶、PCR产物克隆载体pMD18-T Vector、dNTP、DL2000、T4 DNA Polymerase和T4 DNA Ligase均购自大连宝生物工程有限公司；DNA回收试剂盒为Axygen公司产品。各种寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。
1.3 试验方法
1.3.1 银杏DNA提取 采用改良的CTAB法[8]大量提取银杏基因组DNA。
1.3.2 基因组酶切与连接 用平末端限制酶EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ分别进行单酶切，37 ℃酶切过夜（8 h），各取5 μL用0.8%的琼脂糖电泳检测是否酶切完全，酶切产物分别纯化回收；回收后与各自的接头连接，体积为50 μL。连接反应体系为DNA酶切产物（模板）30 μL、T4 DNA Ligase Buffer （10×） 5 μL、接连体10 μL、T4 DNA Ligase 3 μL、ddH2O 2 μL，反应程序为16 ℃连接12 h。
1.3.3 引物设计及染色体步移扩增 根据Genebank提交的银杏MECT基因cDNA序列（登录号DQ102360）分别设计引物MT1、MT2（表1），与2个接头引物AP1、AP2形成巢式引物，进行第一次步移扩增。将得到的目的片段连接到pMD18-T载体上，送出测序。根据第一次扩增的启动子序列，继续设计引物MT3、MT4（表1）进行了第二次步移并测序。
1.3.4 目的片段回收、片段与载体连接、转化及测序 根据琼脂糖电泳检测扩增结果，采用胶回收试剂盒回收所需的目的片段。所用的T载体为pMD18-T Vector，之后与回收片段连接，并转化大肠杆菌进行鉴定和筛选，将含有目的基因重组子的菌株送去测序。
1.3.5 生物信息学分析 用DNAMAN等生物学软件对序列进行处理，然后将测序获得的启动子序列提交至PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）进行在线分析，预测启动子序列保守区域中潜在的顺式作用元件。通过McPromote在线工具预测其转录起始位点。
2 结果与分析
2.1 银杏MECT基因启动子序列克隆及验证
将银杏基因组用8个平末端限制性内切酶（EcoRⅤ、DraⅠ、SspⅠ、PvuⅡ、StuⅠ、HpaⅠ、ScaⅠ和SmaⅠ）分别进行消化，酶切产物加上接头后作为模板与其特异性引物进行步移扩增，经2轮PCR后，电泳检测结果如图1所示，在ScaⅠ的酶切体系中得到了500 bp左右的PCR产物，将产物回收并测序。在第一次步移得到的上游启动子序列（图1A）的5′端设计两个下游引物，继续进行第二次步移扩增，图1B即为第二次扩增结果。将2次步移的产物在Vector NTI软件中进行序列拼接比对，得到了长982 bp的目的片段，通过分析比较证实该片段3′端序列与MECT基因cDNA序列的5′端部分片段重合一致，说明获得的序列为银杏MECT基因上游启动子的部分片段。 2.2 银杏MECT基因启动子区域序列的生物信息学分析
银杏MECT基因启动子序列如图2所示，通过McPromote预测其转录起始位点可能为位于982 bp处的碱基A，将此位点标记为+1。TATA-box位于上游-106 bp处，CAAT-box位于-150 bp处，该启动子序列上含有多种对光照、干旱、伤害、金属离子和细胞周期诱导响应的启动子元件，也含有一些组织特异性启动子元件，依据PLACE database （http：//www. dna.affrc.go.jp/PLACE/）分析结果已将部分作用元件在图示中做了标记。
2.2.1 光调控元件 分析发现银杏MECT启动子序列含有多个与光调节相关的调控元件，如GATA-box （GATA）、GT-1（GRWAAW）等，GT-1存在于许多光调节基因中，是GT-1转录因子结合的保守位点；另有Inr element（YTCANTYY）、ASF1（TGACG）及I-box（GATAA）等均是与光响应有关的顺式元件（表2）。
2.2.2 抗逆境胁迫及与激素响应相关的调控元件 从预测结果分析来看，有些启动子元件既能响应逆境胁迫同时也与激素调节有关，说明逆境胁迫与激素调节存在一定的交叉作用，两者互相关联，体现了启动子作用元件之间的互作性和复杂性。表3中有大量响应激素调节的顺式元件，与细胞分裂素相关的ARR1（NGATT）8个，CPBCSPOR（TATTAG）3个，是依赖细胞分裂素的蛋白质结合位点；与脱落酸响应相关的元件有MYC（CANNTG）和MYB1AT（WAACCA）2种，其中MYC元件有6个；该序列中响应赤霉素的顺式元件较多，其中WRKY（TGAC）是一种赤霉素信号途径的转录抑制子，此类型的调节元件共6个，此外还有TATCCA序列、CAREs （CAACTC）、GARE（TAACAGA）和GA（TAACAAR）；另有2种与生长素作用相关的元件ASF-1 （TGACG）、CATATG序列；与乙烯作用相关的元件仅有1种ACS（TAAAATAT）。响应逆境胁迫的元件有：抗病虫害响应元件TGTCA、抗损伤元件ERF3 （TGACY）、热激响应元件HSE（CCAAT）及防卫基因的诱导元件W-box（CTGACY）。
2.2.3 其他类型调控元件 除对光、激素及逆境胁迫相关的元件外，银杏MECT启动子序列中还存在以下特异性元件：根组织特异性元件rolD（ATATT）、与苯丙氨酸和木质素代谢相关的元件MYBPLANT（MACCWAMC）、受糖抑制作用的元件SRE（TTATCC）、氧胁迫和铜离子响应元件CuRE（GTAC）、淀粉酶响应元件amylase-box（TATCCAT） 等，详见表4。
3 小结与讨论
本试验通过设计特异性引物，采用染色体步移的方法克隆了MECT基因翻译起始位点上游982 bp的启动子序列，对其调控区域进行了生物信息学分析。分析结果表明，银杏MECT基因启动子中含有光响应元件GATA-box（GATA）、GT-1（GRWAAW）及I-box（GATAA）等，其中GATA-box（GATA）是捕光叶绿素a/b蛋白复合体基因（cab）中大量存在的光应答元件，cab即是典型的光依赖型基因。通常GATA-box（GATA）作为一种光开关（Light switches）存在于植物基因启动子中。GT-1 （GRWAAW）存在于某些光诱导启动子中，但也可在不显示光效应的启动子中存在，并且在某些光诱导启动子中，GT-1 缺失也不会完全丧失光调节特性。因此，GT-1在光调节表达中可能不是必需的。I-box是光调节所必需的调控元件，若缺失或突变都会导致启动子光诱导能力下降，在水稻Osrbcs[9]、番茄PSY[10]、豌豆rbcS[11]等基因启动子中都存在。
在银杏MECT基因启动子中还含有各种激素响应元件，与细胞分裂素相关的ARR1（NGATT）元件在作用过程中能与转录因子ARR1结合，是植物对细胞分裂素的应答调节因子[12]。脱落酸响应相关的元件MYC（CANNTG）、MYB1AT（WAACCA）也与逆境胁迫诱导相关，推测当植物处于脱水、干旱等逆境胁迫条件时，MYB、MYC可作为转录因子结合位点，以某种方式促进脱落酸等植物内源激素合成，通过落叶、促进休眠等方式减少养分和水分消耗，以起到抗胁迫作用，维持植物正常生命活动。由此发现，许多响应逆境胁迫的元件同时也是某些激素的响应元件，如ASF-1（TGACG）既是生长素的应答元件同时也是一种抗病害的响应元件。该启动子中还含有热激响应元件HSE（CCAAT），这类热诱导启动子对刺激产生响应的延迟时间短、活性强，一般能快速对高温胁迫作出反应[13]。
由序列分析的预测结果可知，在银杏MECT基因启动子序列中含有许多重要的顺式作用元件。通过分析各种类型元件的作用特点，可以了解影响其作用的因素，从而对萜内酯合成的影响因素做出初步判定，为后面启动子的功能分析提供有效信息。
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