摘要：建立了杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑同时测定的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）分析方法。杨桃样品用乙腈匀浆提取、盐析、石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱净化，乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗脱，浓缩定容，最后通过GC-MS/MS进行分析。农药的添加水平为0.02～0.50 mg/kg时，3种农药的回收率为75.6%～99.0%，相对标准偏差为2.4%～10.4%；内吸磷、抑霉唑和腈菌唑3种农药的定量限分别为0.010、0.020、0.005 mg/kg。该方法能满足杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑3种农药多残留检测的要求。
关键词：杨桃；农药残留；气相色谱-串联质谱
中图分类号：O657.63；S482.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1717-05
内吸磷用于防治蔬菜果树的蚜虫、红蜘蛛、线虫等效果良好，但内吸磷属高毒、高残留的有机磷农药，在中国禁止在蔬菜和果树结果期使用，针对可以使用的果蔬种类，国家也规定其最高残留限量。抑霉唑是一种内吸性杀菌剂，不仅可有效防治果蔬中的许多真菌病害，还对果蔬防腐有特效。腈菌唑属内吸性三唑类杀菌剂，是甾醇脱甲基化抑制剂，常用于防治水果叶斑病、白粉病、黑星病等。
杨桃主要分布于中国南部的福建、广东、海南、台湾等地，这些地区气候温暖，病虫害发生严重，故杨桃上使用的农药种类及频率较高，直接导致食品安全隐患。农药残留对食品安全带来的影响越来越明显，对食品农药残留的检测方法的要求也越来越高。
当前，国内外学者对内吸磷、抑霉唑、腈菌唑的定性、定量检测方法已有较多的探索。目前关于内吸磷[1-5]、抑霉唑[5-10]和腈菌唑[11-15]的检测方法主要有气相色谱法（GC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）、液相色谱法以及液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）。近年来，虽然气相色谱、气相色谱-质谱（GC-MS）检测杨桃中有机磷农药的报道较多[16-18]，但是利用GC-MS/MS检测杨桃中多种农药残留的相关报道很少。相比于GC、GC-MS的检测方法，GC-MS/MS检测技术通过多反应监测模式（MRM）选择特征母离子和子离子形成定量、定性离子对，不仅有效的减少了基质对检测结果的影响，同时定性的准确度和检测的灵敏度也都得到了提升，适用于食品安全领域。
本研究建立了一种利用GC-MS/MS技术对杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑同时进行定性与定量检测的确证方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要试剂 乙腈、正己烷（HPLC级，美国Fisher公司）；毛细管气相色谱柱SLB-5ms（美国SUPELCO公司）；甲苯、氯化钠（分析纯，广州试剂公司）。
1.1.2 仪器和耗材 7000型三重串联四级杆气质联用仪（美国Agilent公司）；T25 basic型高速匀浆机（广州仪科实验技术有限公司）；RE52 CS-1型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；EB-280-12型电子顶载天平（日本岛津公司）；QL-901型旋涡混合器（江苏海门其林医用仪器厂）；石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱（Carbon/NH2，500 mg/6 mL，Agilent Technologies）。标准物质内吸磷、抑霉唑、腈菌唑，纯度≥99%（农业部环境质量监督检验测试中心）。供试材料为杨桃（Averrhoa carambola L.），采自海南。
1.2 试验方法
1.2.1 气相色谱-串联质谱条件 气相色谱条件： 毛细管气相色谱柱SLB-5 ms（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；程序升温初始温度150 ℃，以10 ℃/min升温至200 ℃，以3 ℃/min升温至236 ℃，最后以30 ℃/min升温至280 ℃；总运行时间为18.5 min；载气，氦气（纯度≥99.999%）；恒流模式，流速为1.00 mL/min；进样口温度为260 ℃；进样量为1 μL；进样方式为不分流进样。
质谱条件： 碰撞气流速为2.25 mL/min；离子源，电子轰击源为70 eV；扫描方式，正离子扫描；离子源温度为230 ℃；溶剂延迟为4.00 min；多反应监测，3种农药在串联质谱多反应监测条件下的保留时间、定量离子对、定性离子对以及碰撞能量见表1。
1.2.2 样品处理 称取样品25.00 g（精确至0.01 g）于150 mL烧杯中，加入50.0 mL乙腈，在匀浆机中高速匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有5 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，收集全部滤液，盖上塞子，剧烈震荡2 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分离。准确吸取10.00 mL上层乙腈提取液于50 mL 圆底烧瓶中，在40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，用2 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）溶解残渣，漩涡混匀，待净化。固相萃取柱中加5 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）预洗柱，当液面接近柱吸附层表面时，立即加入上述待净化溶液，用100 mL圆底烧瓶收集洗脱液，用2 mL 乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗圆底烧瓶后过柱，并重复两次；最后用20 mL乙腈/甲苯（3∶1，V/V）洗脱，合并于100 mL圆底烧瓶，将圆底烧瓶40 ℃水浴下旋转蒸发至近干，氮气吹干后，最后用正己烷定容至5 mL，在混合器上混匀后，若残留量较低时，可以定容至2 mL，待GC-MS/MS测定。
1.2.3 添加回收率与精密度测定 称取4组经测定不含上述3种农药残留的杨桃空白样品，每组5个重复，在空白样品中分别添加浓度水平为0.02、0.05、0.10、0.50 mg/kg，按照上述提取和色谱操作条件进行分析，计算添加回收率和相对标准偏差。
2 结果与分析 2.1 样品处理净化条件优化
2.1.1 提取剂的选择 内吸磷、抑霉唑和腈菌唑均微溶于水，溶于一般有机溶剂如乙腈、丙酮、正己烷等。对于提取剂的选择，本试验采用回收试验法比较了常用分析农药残留的提取剂（乙腈、丙酮和正己烷），结果表明，使用丙酮为提取剂时，丙酮与水互溶导致水相和有机相分层不明显，从而造成回收率较低；使用正己烷作为提取剂时，虽然正己烷与水不互溶，但是提取效率仍没有乙腈高；选用乙腈为提取剂，样品回收率满足农药残留检测方法的要求，故选用乙腈为提取剂。
2.1.2 固相萃取柱的优化 氨基柱（NH2）是键合相为氨丙基的硅胶基质小柱，同时具有氢键和阴离子交换的性质，能促进结构异构体的分离，并且有效地去除脂肪酸、有机酸和糖等杂质；石墨化碳黑柱（Carbon）填充了高纯的石墨化碳颗粒，其表面的正六元环结构使其对平面分子有极强的亲和力，适用于绝大部分农药的萃取和净化；石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱（Carbon/NH2）集中了石墨化碳黑和氨基两种填料的优势，可以有效去除食品中的色素、甾醇、脂肪酸、有机酸和糖类等杂质，适合于不同极性农药的多残留检测。比较了农残检测中常用的固相萃取柱（NH2柱、Carbon柱、Carbon/NH2混合型柱）的净化和回收效果，结果表明，Carbon/NH2混合型柱净化后，洗脱比较干净，去除干扰的效果最好，可获得较理想的回收率。WATANABE等[19]利用Carbon/NH2混合型柱净化农产品中的7种新烟碱类杀虫剂。陈红平等[20]同样采用Carbon/NH2混合型柱净化处理样品建立了气相色谱-质谱法同时测定茶叶中72种农药残留量的方法。本试验检测的杨桃样品含糖量在10%以上，同时其有机酸含量也较高，利用Carbon/NH2混合型柱可以有效去除糖类等杂质，因此本方法最终依据结果选择Carbon/NH2混合型柱为净化柱。
2.2 待测农药定量和定性离子的选择
首先，分别将3种农药的标准品溶液（1.0 mg/L）在m/z 0～500之间进行全扫描分析（Full Scan），确定每种农药的保留时间（表1）和质谱图（图1）。从质谱图中找出各组分的一级碎片离子作为母离子，母离子的选择主要考虑5个方面因素：特征性高、质量数高、对称性高、重现性好且不同于柱流失碎片离子。综合考虑，选择适宜的离子初步定为母离子。其次，选择子离子，应用离子轰击扫描对母离子在不同碰撞能量下进行电离轰击，确定二级质谱图，选择强度较大、灵敏度高的为子离子。对每一组离子对分别选择碰撞能量为5、10、15、20、25、30、35、40 eV进行扫描，以响应强度大小为依据对碰撞能量进行选择，再在此基础上对选择的碰撞能量进行微调，对碰撞电压进一步优化，使得最终监测的子离子产生最强响应。选择丰度最高的一对子离子进行定量分析，选择丰度次高的一对子离子进行定性分析，表1给出了优化后的多反应监测条件。图2是3种农药（0.20 mg/L）在表1条件下得到的多反应监测总离子流图，从图2中可以看出所有谱峰峰形尖锐、对称性好、各谱峰间完全分离。
2.3 线性方程、定量限、回收率和精密度
2.3.1 线性方程 将一定浓度的混合标准工作溶液，按“1.2”所述分析条件进行测定，以内吸磷、抑霉唑和腈菌唑标准溶液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制线性关系曲线，对测定结果进行线性相关分析。结果表明，在0.02～0.50 mg/kg内线性关系良好（表2）。
2.3.2 定量限 定量限是指可以进行准确定性和定量测定的最低水平。不同水平下得到的准确度应满足以下要求：添加水平在0.001～0.010 mg/kg时，回收率为60%～120%，相对标准偏差应≤30%；添加水平在0.01～0.10 mg/kg时，回收率范围为70%～120%，相对标准偏差应≤20%；添加水平在0.1～1.0 mg/kg时，回收率应在70%～110%，相对标准偏差应≤15%。添加标准溶液质量浓度得到的信噪比一般为10。根据3倍信噪比（S/N）计算杨桃中3种农药的检出限（LOD）为0.000 9～0.006 0 mg/kg，根据10倍信噪比确定的定量限（LOQ）为0.003～0.020 mg/kg，为配合实际样品和定量准确，本试验从添加水平0.003～0.020 mg/kg，通过添加回收率试验和准确定量的要求，因此，杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑的定量限通过实际添加回收试验最终确定为0.010、0.020、0.005 mg/kg，详见表3。
2.3.3 回收率和精密度 方法的准确度是指所得结果与真值的符合程度，农药残留检测方法的准确度一般用回收率进行评价。重复性一般做3个水平试验，每个水平重复次数不少于5次。本试验选择4个水平试验对方法的准确度进行验证，在4组各5个空白样品中分别添加浓度水平为0.02、0.05、0.10、0.50 mg/kg的混合标准溶液，按照上述提取和色谱操作条件进行测定，计算回收率和精密度。结果表明，3种农药残留的平均回收率为75.6%～99.0%；5次平行测定的相对标准偏差为2.4%～10.4%，均满足定量分析要求，结果见表4。
3 小结与讨论
本试验建立了杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑的GC-MS/MS分析检测方法。杨桃样品经乙腈匀浆提取，石墨化碳黑/氨基混合型固相萃取柱净化，GC-MS/MS检测。在0.02～0.50 mg/kg下进行添加回收试验，3种农药的平均回收率为75.6%～99.0%，相对标准偏差为2.4%～10.4%（n=5）；方法的线性范围为0.02～0.50 mg/L，相关系数大于0.99；内吸磷、抑霉唑和腈菌唑的定量限分别为0.010、0.020、0.005 mg/kg。该方法简单、灵敏度和准确度高，可实现杨桃中内吸磷、抑霉唑和腈菌唑残留的定性与定量检测。
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