摘要：马铃薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）是危害我国马铃薯的主要病毒之一。利用马铃薯Y病毒通用ELISA试剂盒确定所携带Y病毒的试验材料，设计了特异性引物通过反转录PCR获得PVY CP基因序列，通过克隆PVY衣壳蛋白基因（Coat protein， CP）序列分析其进化与变异类型。结果表明，分离得到11株病毒，依据其CP序列特性分为4类；宁夏地区主要流行的病毒类型为PVYO进化分枝，同时也可能出现了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被检出病毒分离株的9.1%。结果揭示了宁夏地区PVY的进化与变异类型，有助于针对性地防控PVY。
关键词：马铃薯（Solanum tuberosum）；马铃薯Y病毒；分子变异
中图分类号：S532 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5558-04
马铃薯（Solanum tuberosum）Y病毒（Potato virus Y， PVY）在世界各地均有报道，其能侵染34个属170余种植物，但主要以茄科作物为主[1]。PVY是危害我国马铃薯的主要病毒之一[2]。PVY包括3个株系组：马铃薯Y病毒普通株系组（PVYO）、马铃薯点条斑株系（PVYc）、马铃薯Y病毒褐脉株系（PVYN）[3]。PVY染病植株25 ℃时其体内病毒浓度最高，有利于该病的发生；30 ℃时染病植株体内病毒浓度最低，表现为隐症。PVYO和PVYC初期感染症状主要是叶片坏死和斑驳；PVYN则导致不同程度的花叶。PVYO和PVYC继发侵染的植株表现出矮化、皱缩、斑驳和卷曲等症状；而PVYN感染植株通常为花叶和斑驳，当温度低于10 ℃和高于25 ℃时，不表现花叶症状。PVY通常不引发块茎病症，但近年来在欧洲出现PVYN中的一个株系PVYNTN，PVYNTN株系具有PVYN株系的血清型，在烟草和马铃薯地上部分引起的症状与PVYN株系相似。同时PVYNTN株系还可引起马铃薯块茎坏死、环斑病，在块茎的内部或外部引起环状、弧状坏死斑，严重影响马铃薯的品质和经济价值[1]。
血清学方法最常用于PVY株系的鉴定，但单纯的血清学关系已被证明不完全可靠，因为许多病毒编码的蛋白质都有高度保守的区域，即使亲缘关系很远的病毒在这些保守区域序列也可能相近，导致血清学反应难以区分。近年来，随着基因测序技术的成熟，大量病毒衣壳蛋白（Coating Protein，CP）基因的序列被测定，而且测定了不少病毒的全序列。CP基因序列分析在一定程度上对阐明PVY分类具有一定的参考作用[4，5]。
RNA植物病毒的遗传多样性主要由突变、重组、重排等因素造成[6-8]，以快速适应多变的生存环境。PVY突变频率较高、重组频繁，造成遗传多样性变化很大，因此能在不同寄主和不同环境中生存与传播。研究病毒变异和进化有助于了解病毒的起源、进化机制、分类关系和种群遗传结构的形成。本研究对宁夏地区流行的马铃薯Y病毒CP基因进行测序，研究其分子变异，有助于掌握该病毒的变异类型与流行区域，从而更为有效地防控该病毒的大面积流行。
1 材料与方法
1.1 材料
2011年，在宁夏固原农业推广总站马铃薯种质资源圃中，收集195份疑似携带马铃薯Y病毒样本。该资源圃中种植了目前全区大多数主栽马铃薯品种，选择有病理症状明显，从植株的顶部、中部和底部各取一片叶子合在一起，带回实验室-70 ℃低温保存。
1.2 试剂
马铃薯Y病毒通用ELISA试剂盒购于安德珍生物公司；SV Total RNA Isolation System RNA提取试盒、mProm-II Reverse Transcriptase RNA反转录试剂盒、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于Promega公司；Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000 plus购于天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；其他化学试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 马铃薯Y的鉴定 称取0.10～0.15 g马铃薯病叶样品放置于样品袋中，并标记；然后向样品袋中加入1.0～1.5 mL试剂盒提取缓冲液，将样品充分研磨；将样品袋中的溶液转移到1.5 mL的离心管中，4 000 r/min离心3 min，取上清液备用。按试剂盒说明进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）鉴定马铃薯病叶样品，在典型阳性植株中根据显色吸光度由高到低选取11株备用。
1.3.2 马铃薯总RNA的提取 采用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取样品总RNA，然后保存于-70 ℃超低温冰箱备用。
1.3.3 引物设计 从GenBank中获得PVY CP基因核苷酸序列（HQ631374.1、AY601680.1、HM036202.1），并利用BLAST和Clustal软件进行保守性分析，上游引物序列PVY_CPF：5′-GGAAATGACACAATCGATGCAGG-3′和下游引物序列PVY_CPR：5′-CATGTTCTTGACTCCAAGTAGAG-3′。
1.3.4 RT-PCR扩增PVY CP基因 取2 μg马铃薯总RNA，以Oligo dT为引物，进行总cDNA反转录。以PVY_CPF、PVY_CPR为引物，cDNA反转录产物为模板PCR扩增PVY CP基因。PCR反应体系为25 μL，包含10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1 μL，Pfu高保真聚合酶（5 U/μL）1 μL，总cDNA模版（1 μg/μL）1 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，并送天根生化科技（北京）有限公司进行测序。 1.3.5 PVY CP基因序列分析 对PVY CP基因序列进行BLAST比对，DNAMAN7.0进行生物信息学分析。进化树采用MEGA软件绘制，计算方法采用Neighbor-joining方法[9]。
2 结果与分析
2.1 PVY阳性植株的鉴定
经PVY通用ELISA试剂盒鉴定的阳性植株分别编号为PVY14，PVY24，PVY29，PVY31，PVY35，PVY36，PVY47，PVY58，PVY59，PVY60，PVY63。
2.2 PVY CP基因的克隆
利用RNA提取试剂盒提取阳性马铃薯植株叶片总RNA电泳结果见图1，泳道1、2均为PVY阳性植株。以PVY_CPF、PVY_CPR为引物，以反转录为模板进行PVY CP基因的RT-PCR扩增，结果见图2。由图2可知，11个样品扩增出了801 bp的目标片段，与预期大小一致，表明成功扩增出了CP基因。
2.3 PVY CP基因的生物信息学分析
11个样品PVY分离株 CP基因的序列与GenBank 上已公布的PVY 不同分离株CP基因序列核苷酸序列同源性均在89.5%以上（表1）。其中，PVY59、PVY63与PVYNTN-NW株系的一致性达99.4%。根据Potyvirus 病毒划分种的标准，当CP基因的核苷酸序列一致性高于76%时，应归为同一个种。因此，11个分离株应为PVY分离株。
11个分离株中其核苷酸序列一致性为98.82%，共计57个位置碱基发生了变化，且多为同义突变即编码的氨基酸序列没有发生变化，编码267个氨基酸序列，造成16个氨基酸序列存在变异（图3）。
该地区PVY的亲缘关系见图4。由图4可知，11个分离株可分为4类。第一类PVY29、PVY31、PVY58、PVY24、PVY47、PVY36属于PVYN：O株系，与高芳銮等[10]鉴定的14个不同省份PVY分离株（图4中蓝色框标识部分）聚类到一起，但是明显具有一定的区域性。这说明在本地区马铃薯长期种植过程中，PVY病毒进化有别于其他省份分离得到的病毒株系，发展成为较新的一类型。第二类PVY14、PVY59、PVY63属于PVYNTN-NW株系，与第一类同属于PVY O型这一进化分枝；第三类PVY60，介于PVY O型化分枝和C型化分枝之间。第四类PVY35，与本次分离得到的其他株系关系较远，同源性仅为93%，因此，将此分离株CP基因序列注册GenBank，登入号为JN635310.1，与PVYNTN株系亲缘关系较近，可能是一种新的PVYNTN株系变种。
2.4 宁夏地区PVY类型分析
在核苷酸水平根据PVY CP基因第50位和86位核苷酸是A与否，可将PVY35分离株确定为PVYN型或PVYNTN型，其余分离株为PVYo型[2]。在蛋白质水平，根据PVY CP蛋白第98和99位氨基酸为QL大多属于PVYNTN型，为RM大多属于PVYo[11]。分离株PVY35可能为PVYNTN型，其余分离株属于PVY O型进化分枝。据此，推测宁夏地区主要流行的病毒类型为PVY O型进化分枝，分属于PVYNTN、PVYNTN-NW和PVYO 3种病毒类型，占调查总数的90.9%（10/11），但是也可能出现了具有高致病性的PVYNTN新株系，占调查总数的9.1%（1/11）。
3 小结与讨论
PVY不同株系间可能具有相同的血清型或生物学特性，单独利用免疫学技术和接种鉴别寄主等方法均无法对各株系进行准确鉴定。以PCR为主要手段的分子检测能很核苷酸水平准确检测其基因型，这对快速掌握和防控PVY流行趋势具有一定的指导意义。本研究设计的引物为扩增PVY CP基因全长序列，其能提供更多的分型位点，在一定程度上弥补了血清学检测的不足。通过PVY通用型ELSIA试剂盒对宁夏地区马铃薯疑似病株进行检测，共检测出11株PVY分离株，对这些病毒的衣壳蛋白基因进行测序，可以划分为4个类型；宁夏地区主要流行的病毒类型为PVYo，但也可能出现了具有高致病性的PVYNTN新株系，占到被检出病毒的9.1%。
近20年来，很多人在全球范围研究PVY在马铃薯中的传播和重组。在欧洲，PVYNTN和PVYN-Wi型已经替代了PVYO和PVYN；在美国和加拿大，PVYO仍然是主要流行病型，PVYN较少，但是重组型有增长的趋势并偶有分布。高芳銮等[10]对中国PVY病毒进行了CP基因变异研究，但没有宁夏地区病株材料。本研究中，在宁夏地区195份疑似病株中仅检测出PVY病毒11株，仅占整个检测材料的5.64%，这个原因可能是由于多病毒复合感染，造成类似表型。
参考文献：
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