摘要：大白菜根肿病是一种严重影响大白菜生长的土传病害，已成为大白菜的重要病害之一。CRb基因是抗大白菜根肿病的重要基因。本研究对已发表的6个CRb分子标记进行筛选，获得1个与CRb紧密连锁的共显性标记TCR05。该标记在抗病纯和材料中产生279 bp的PCR扩增片段，在感病材料中产生250 bp的PCR片段，在抗病杂合材料中同时产生279 bp和250 bp的PCR片段。利用TCR05对24份育种材料进行筛选，均含CRb基因，其中8份为纯合体，16份为杂合体，筛选结果与田间鉴定结果基本一致。
关键词：大白菜；根肿病；CRb；分子标记；种质资源
大白菜是原产于中国的重要蔬菜作物。大白菜根肿病是由芸薹根肿菌侵染所致的一种土传性病害[1]。根肿菌自大白菜根毛侵入细胞内，从根部皮层进入形成层，根部薄壁细胞受刺激而加速分裂，导致根部长出肿瘤，植株萎蔫死亡[2]。迄今，至少有8个大白菜抗根肿病基因得到定位，分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和 CRk[3～7]。其中，CRb对根肿菌生理小种2、4和8均具有良好抗性，并表现为单基因显性遗传特性[6]。本研究对已发表的6个CRb标记进行验证，并对24份抗性种质资源进行分析，以期在大白菜抗根肿病育种中对CRb基因的跟踪和提供抗性种质资源提供支持。
1材料与方法
1.1试验材料
供筛选与基因CRb紧密连锁标记的试材为抗根肿病大白菜自交系YH-036、感根肿病自交系冠291以及两者的杂交组合。
供筛选种质资源共24个（表1），其中BCYM-1～BCYM-4和ZY-1～ZY-4为8个抗根肿病大白菜自交系，其他16个为日本和韩国种子公司正在测试尚未推广的新品种。每个自交系和品种选取最优良的单株进行测试。
1.2试验方法
1.2.1抗根肿病基因CRb分子标记供试引物及其序列供筛选的与基因CRb紧密连锁的6对引物及其序列见表2。
1.2.2DNA提取及PCR扩增利用改良CTAB法提取大白菜基因组DNA[8]。用于PCR反应的试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
PCR反应总体积为20 μL：在96孔的PCR板中分别加入PCR Master Mix（2×） 10 μL，上游引物和下游引物（10 U）各1 μL，50 ng/μL的模板DNA 2 μL，ddH2O补齐至20 μL。
PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性0.5 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃重延伸10 min，4℃保存。
PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电压5 V/cm条件下电泳1 h，用Goodview染色，Bio-RAD凝胶成像系统成像，观察并保留结果。
1.2.3分子标记筛选分别取YH-036、冠291和其杂交组合各16株用6对候选引物进行PCR扩增和分析，筛选出最佳的分子标记。
1.2.4大白菜种质资源PCR鉴定利用筛选的分子标记对24份大白菜种质资源进行鉴定分析。
1.2.5大白菜种质资源抗病性调查大白菜种子催芽后播种于50孔穴盘，穴盘中所用基质均经过高温灭菌，放置在光照培养箱中培养。每份大白菜种质资源设4个重复，每个重复6株，随机排列。
将高感根肿病病株的病根清洗干净后称重，加入适量的水，用粉碎机磨碎至匀浆与灭菌基质混合，用血球计数板计数使浓度达到2×108个孢子/g基质，并将土壤pH值调整至5.5左右，为病菌发病营造良好条件。
待大白菜苗长至3～4片真叶时移栽至加入菌土的营养钵中，保持基质湿度60%左右，置于25℃光照培养箱中培养40天后，对植株进行抗病性调查。将植株取出后，洗净根部泥土，调查记录抗病性。主根和侧根或须根都无肿瘤记为抗病，只要在主根、侧根或须根出现肿瘤，不分大小均记为感病。
2结果与分析
2.1分子标记筛选
6对候选引物对大白菜抗、感病自交系及其杂交组合的PCR扩增结果表明，只有TCR01和TCR05能扩增出鉴定大白菜抗根肿病基因CRb呈阳性或隐性的共显性特异性条带。其中TCR05在抗病自交系YH-036中扩增出一条279 bp的PCR片段，在感病自交系冠291中扩增出一条250 bp的PCR片段，在其杂交组合中扩增出与其亲本对应的两条条带（图1），与文献[6]报道一致，且在多次重复试验中表现稳定。因此，TCR05可以作为鉴定大白菜抗根肿病基因CRb呈阳性或隐性的理想分子标记。
2.2大白菜种质资源PCR鉴定
利用分子标记TCR05对24份大白菜种质资源CRb基因进行鉴定分析（表3）。如图2所示，TCR05在24份大白菜资源中均能扩增出PCR片段，其中1～8号种质资源均只扩增出一条279 bp的抗病片段，鉴定为CRb/CRb纯合的种质资源；其他16份材料中均分别扩增出279 bp的抗病片段和250 bp的感病片段，鉴定为CRb/crb杂合的种质资源。
2.3大白菜种质资源抗病性鉴定结果
供试的24份大白菜种质资源总体表现为抗根肿病，但11、18、24号种质资源中个别单株出现了肿瘤。其中，11号供试材料的侧根共出现3个直径5 mm左右的肿瘤，地上部病症表现不明显；18号供试大白菜资源的主根共出现5个3 mm左右的肿瘤，地上部表现出失水萎蔫现象；24号仅在须根部位出现细微突起，地上部植株生长无明显影响（表4）。
3讨论与结论
根肿病最早于1737年在英国地中海西岸和欧洲南部发现，现已成为一种世界性病害[9]。近年来，我国大白菜根肿病发病范围迅猛扩大，面积急剧增加，造成大白菜产量和品质大幅度降低，已成为大白菜主要病害之一。生产实践证明，栽培措施和化学、生物等防治方法不仅效果甚微而且化学防治污染环境[10]，选育抗根肿病大白菜新品种是一条有效、经济和环保的途径[11]。源于欧洲芜菁的多个抗病基因已成功导入到大白菜种质中，但目前大白菜根肿病的抗性检测主要采用人工接种鉴定方法，接种效果受外界环境的影响大、效率低，不能鉴定抗性基因的类型[12]。因此，育种中急需运用分子标记辅助育种方法弥补人工接种的缺陷。本研究筛选出一个与抗病基因CRb紧密连锁的SCAR标记TCR05，具有结果稳定可靠、操作简便、效率高、可鉴别杂合子和纯合子等优点，可有效用于今后抗根肿病大白菜育种工作中。 Piao等（2004）[6]利用韩国和日本的10个感病品种和37个抗病品种对CRb位点开发分子标记，在抗病品种中有18个品种含有TCR01和TCR05标记，在感病品种中均未扩增到这2个标记。本研究利用TCR05对源于日本和韩国的24份较新抗根肿病种质资源进行鉴定，均鉴定出抗病基因CRb的存在，说明抗病基因CRb在国外抗根肿病大白菜品种中已得到广泛采用，应引起我国育种工作者的重视。
本研究人工接种试验证明，含有杂合基因CRb的大白菜种质资源11、18、24号表现出不同程度的感病性，而其他21份种质资源均表现为抗根肿病，与分子标记的结果不完全一致。迄今为止，对于大白菜抗根肿病基因的类别、效应方式、基因间相互作用等研究不够深入，目前已发现的8个与根肿病抗性有关的基因位点分别是Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和 CRk，其中，Crr3、CRa、CRb、CRk均位于染色体A03上，Crr1、Crr2和Crr4分别位于染色体A08、A01和A06上，CRc位于染色体A02上。从大白菜种质资源11、18、24号表现出不同程度的感病性来分析，基因CRb对根肿病的抗性可能与其它抗病性基因有关联，存在加性效应等基因互作效应，这一假设值得进一步验证，以期为今后抗病育种提供理论依据。
参考文献：
[1]杨永林.十字花科蔬菜根肿病抑菌型土壤初探[J].植物保护学报，1990， 17（2）：127-131.
[2]杨佩文，尚慧，董丽英，等.大白菜根肿病发病因素分析与防治技术[J].西南农业学报，2009，22（3）：663-666.
[3]Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Identification of two loci for resistance to clubroot （Plasmodiophora brassicae Woronin） in Brassica rapa L. [J]. Theor. Appl. Genet.， 2003，107：997-1002.
[4]Suwabe K， Tsukazaki H， Iketani H， et al. Simple sequence repeat-based comparative genomics between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana： the genetic origin of clubroot resistance[J]. Genetics，2006，173：309-319.
[5]Hirai M， Harada T， Kubo N，et al. A novel locus for clubroot resistance in Brassica rapa and its linkage markers[J]. Theor. Appl. Genet.， 2004，108：639-643.
[6]Piao Z Y， Deng Y Q， Choi S R， et al. SCAR and CAPS mapping of CRb， a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage （Brassica rapa ssp. pekinensis）[J]. Theor. Appl. Genet.， 2004， 108（8）：1458-1465.
[7]Sakamoto K， Saito A， Hayashida N， et al. Mapping of isolate-specific QTLs for clubroot resistance in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis） [J].Theor. Appl. Genet.， 2008，117：759-767.
[8]Wang X W，Lou P，Bonnema G，et al. Linkage mapping of a dominant male sterility gene Ms-cd1 in Brassica oleracea[J].Genome，2005， 48：848-854.
[9]沈向群，聂凯，吴琼，等.大白菜根肿病主要生理小种种群分化鉴定初报[J].中国蔬菜，2009（8）：59-62.
[10]黄云.植物病害生物防治学[M].北京：科学出版社，2010：291-292.
[11]张慧.不结球白菜抗根肿病材料创制、抗性遗传及分子标记研究[D].南京：南京农业大学，2013.
[12]李巧云，张志刚，赵智中，等.大白菜抗根肿病分子标记研究进展[C]//中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集.2012：21-29.
