摘要：采用透明圈法从舟山普陀白山土壤中筛选出3株能分泌胞外蛋白酶的菌株，并对蛋白酶活力最高的菌株进行分子鉴定及最适宜生长条件分析。选择福林酚试剂法测定其蛋白酶活力，对蛋白酶活力最高的菌株进行16S rRNA基因测序，用MEGA软件构建系统发育树，并考察其接种量、温度、时间对该菌株产酶活力的影响。结果表明，zjoub-1菌为高产蛋白酶菌属，并确定为枯草芽孢杆菌。该菌株用于金枪鱼暗色肉发酵时的最适宜条件为接种量2%、pH 7.4、温度37 ℃、时间48 h。在此生长条件下，菌株产蛋白酶活力最高，为49.21 U/mL，能够有效地降解金枪鱼暗色肉。
关键词：金枪鱼肉；透明圈法；福林酚试剂法；筛选；鉴定；生长条件
中图分类号：S965.332 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2506-06
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.027
Screening and Identification of A Strain with High Protease in Fermentation of Tuna Dark Meat
WU Li-na1，ZHAO Xiao-hui1，GUO Kai-qing1，YANG Yu-jie1，FANG Xu-bo1，2，CHEN Xiao-e1，2，ZHANG Yin-zhao3
（1.College of Food and Medicine， Zhejiang Ocean University， Zhoushan 316022， Zhejiang，China；
2.State Key Laboratory of Aquatic Products Processing of Zhejiang Province， Zhoushan 316022，Zhejiang，China；
3.Zhejiang Fengyu Biological Products Limited Company， Zhoushan 316104， Zhejiang，China）
Abstract：Using Three strains of bacteria secreting extracellular protease were isolated from soil of Baishan in Zhoushan by transparent circle method， the bacterium with highest protease activity was identified and the most suitable growth conditions was studied. The collected samples were screened by transparent circle method to get three pure strains whose protease activity would be measured by Forint phenol reagent method. The strain with the highest protease activity was identified by the 16S rRNA sequence analysis and the phylogenetic tree was constructed by MEGA software. The inoculation amount，temperature，time and pH had been analyzed on the influence of its protease activity. The results showed that the study demonstrates that the zjoub-1 strain with highest protease activity was defined as bacillus subtilis. The optimal condition for fermentation of Tuna dark meat was as follows： the inoculation quantity was 2%，the incubation temperature was 37 ℃， the incubation time was about 48 h， the initial pH was 7.4. Under this circumstance， the strain has the highest protease activity， which illustrates that the strain with high protease activity can degrade the Tuna dark meat efficiently.
Key words：Tuna dark meat；transparent circle method；Forint phenol reagent method；isolation；identification；growth conditions
近年恚舟山市水产加工企业纷纷抢抓泰国金枪鱼加工部分向中国转移的机遇，及时调整生产线，积极拓展金枪鱼原料加工贸易，大力发展中间产品加工，金枪鱼肉加工业呈现出蓬勃发展的势头。金枪鱼在加工处理过程中会产生高达6成以上的暗色肉、表皮、鱼骨及内脏等下脚料，其中暗色肉占50%以上[1]，但是由于国内加工技术落后及关键加工设备研发滞后，这些下脚料目前只能被简单加工成饲料鱼粉，产品附加值低，也有部分被直接丢弃，不仅污染环境，而且造成资源的浪费[2]。因此，加大对这类低值下脚料的开发研究力度，已经成为浙江省金枪鱼加工产业链发展的重中之重。 研究表明，金枪鱼暗色肉是一种优质的饲用蛋白原料[3]，具有较高的蛋白质含量，其氨基酸组成也较平衡。除了加工饲料鱼粉外，目前国内对于金枪鱼暗色肉等下脚料的利用研究主要集中在通过酶解法制备饲用肽上，对金枪鱼暗色肉的微生物发酵研究相对较少。研究表明，采用微生物发酵法制备饲用肽能够提高饲用肽的适口性及其蛋白质含量，提高消化吸收利用率，而且减少了肽酶和脱苦的成本，简化了生产工序。
蛋白酶是一类广泛应用于纺织、食品、医药、洗涤剂、有机合成及制革脱毛等方面的重要工业和研究用酶[4]，其份额占整个酶制剂市场的一半以上。蛋白酶既可以从动植物组织中直接提取，也可以通过微生物发酵工艺进行大规模生产[5]。目前，生产蛋白酶制剂主要利用霉菌、酵母菌、芽孢杆菌等微生物发酵制备。随着蛋白酶应用的日趋广泛，急需分离筛选能分泌具有较高蛋白酶活力并适用金枪鱼暗色肉发酵大规模生产应用的菌株[6]。
本研究结合透明圈法从土壤中筛选得到3株产蛋白酶的菌株，选出产蛋白酶活力最高及透明圈（H/C）值最大的菌株，通过16S rRNA基因测序及系统发育树构建对其进行分子鉴定，拟为具有高蛋白酶活力饲料添加剂的研发提供参考菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
对采自舟山普陀区白山的土样进行分离筛选及鉴定。
试管斜面培养基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂15 g/L，调节pH至8.0，121 ℃灭菌20 min备用。
脱脂牛奶固体培养基：脱脂奶粉10 g/L，琼脂20 g/L，水1 L，pH 7.2～7.4，115 ℃灭菌15 min备用。
酪素培养基：KH2PO4 0.36 g/L，MgSO4 0.5 g/L，ZnCl2 0.014 g/L，Na2HPO4・7H2O 1.07 g/L，NaCl 0.16 g/L，CaCl2 0.002 g/L，FeSO4 0.002 g/L，干酪素4 g/L，Tryptilase 0.05 g/L，琼脂20 g/L，调节pH至7.0，121 ℃灭菌20 min备用。
摇瓶培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，去离子水1.0 L，pH 7.0。
种子培养基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，调节pH至8.0，121 ℃灭菌20 min备用。
SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；UV-6000型紫外分光光度计：苏州江东精密仪器有限公司；四方均质器：铁道部电化院四方电气设备厂；HHS型电热恒温水浴锅：上海棱光技术有限公司；BS110型电子分析天平：北京赛多利斯天平有限公司。
1.2 方法
1.2.1 产蛋白酶菌株的富集、分离纯化及筛选 称取1 g经处理的土样加入装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，用六层纱布封口，置于80 ℃水浴锅中加热10 min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。然后在30 ℃、150 r/min的条件下振荡培养24 h，取样镜检形成芽孢的情况。取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 5个梯度。分别取0.1 mL菌液于无菌的酪素培养基平板上，用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30 ℃培养箱中培养24～48 h。观察酪素平板上菌落周围的透明圈，观察透明圈状况[7]。以透明圈的直径（H）/菌落直径（C）表示菌株产蛋白酶的状况。挑取（H/C）值较大的菌株接入试管斜面培养基，30 ℃培养24 h，备用。观察在平板上得到的优势菌落，选取形态特征一致的单菌落，在脱脂牛奶固体培养基上多次划线分离，经过数次培养后得到纯化的单菌落。观察菌落特征，选择不同颜色及形态的单菌落，接种于斜面保存培养基，置于冰箱中保存。
1.2.2 菌株蛋白酶活力测定
1）发酵种子液的制备。轻轻刮取一h经斜面活化后的菌株接种至装有50 mL摇瓶培养基的250 mL三角瓶内，于37 ℃、150 r/min的条件下振荡培养20 h后，作为暗色肉发酵种子液备用。使用前，种子液稀释至菌体浓度为108个/mL[8]。
2）蛋白酶活力测定方法。按照国标福林酚试剂法[9]测定这3株菌发酵液蛋白酶活力。通过比较这3株菌发酵液蛋白酶活力的大小，选出蛋白酶活力最强的菌株及透明圈（H/C）值大的菌株进行分子鉴定。
1.2.3 菌株的鉴定
1）菌落形态和个体形态观察。将制备的菌悬液稀释到合适的稀释度，取0.1 mL涂布于脱脂牛奶固体培养基上，于30 ℃培养箱培养48 h，观察单菌落形状、颜色、是否湿润、边缘情况等。革兰氏染色具体操作方法参照文献[10]。
2）菌株的分子鉴定。菌株的分子鉴定具体操作方法参照文献[11]。
1.2.4 菌株产蛋白酶活力的单因素试验
1）发酵温度对菌株产蛋白酶活力的影响。将筛选所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接种量接至装有50 mL摇瓶培养基的250 mL三角瓶中，分别选择0、23、30、37、44 ℃进行发酵，每隔48 h后取样，测定其蛋白酶活力[12]。
2）发酵时间对菌株产蛋白酶活力的影响。将筛选所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接种量接至装有50 mL摇瓶培养基的250 mL三角瓶中，发酵温度37 ℃，分别发酵0、12、24、36、48、60 h后取样，测定其蛋白酶活力。
3）接种量对菌株产蛋白酶活力的影响。将筛选所得蛋白酶活力最高的菌株按0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%接种量接至装有50 mL摇瓶培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃发酵48 h后，测定其蛋白酶活力。 4）pH对菌株产蛋白酶活力的影响。将筛选所得蛋白酶活力最高的菌株以2%接种量接至装有50 mL摇瓶培养基的250 mL三角瓶中，发酵温度37 ℃，pH分别设置为0、1.9、3.8、5.7、7.4、9.3，发酵48 h后，测定其蛋白酶活力。
2 结果与分析
2.1 菌种鉴定结果
2.1.1 菌株的分离纯化结果 经过一系列的筛选、分离及纯化，从土壤中筛选出3株产蛋白酶的菌株，观察菌落形态特征、革兰氏染色结果及（H/C）值，结果见表1。从表1中可以看出，不同的菌株有不同的菌落特征，其中zjoub-1菌株在3种菌株当中菌体最大，呈米白色，一般为圆形，不透明，湿润，光滑，培养时间较长或者温度较高条件下会出现皱褶，菌落中央出现深色的伞状线，革兰氏染色下呈短杆状，革兰氏阳性，zjoub-1菌平均透明圈（H/C）值为3.68；zjoub-2菌株菌体大小适中，湿润，有光泽，菌落颜色呈淡黄色，革兰氏染色下呈短杆状，革兰氏阳性，其平均透明圈（H/C）值为3.23；zjoub-3菌株菌体最小，呈半透明，湿润，光滑，菌落颜色为白色，革兰氏染色下呈球状，革兰氏阴性，其平均透明圈（H/C）值为2.79。试验结果表明，3株菌株都能在筛选培养基上形成明显的水解透明圈。其中，zjoub-1菌株透明圈直径与菌落直径的比值均最大，说明其分解蛋白质的能力最强。
2.1.2 菌株的透明圈 zjoub-1菌株、zjoub-2菌株及zjoub-3菌株经过一系列的分离纯化，最终得到的培养48 h后的菌株透明圈如图1所示。由图1可知，菌落在脱脂牛奶固体培养基上形成的水解圈明显，脱脂牛奶固体培养基主要成分为蛋白质，整个平板呈乳白色，由于菌株能产生蛋白酶，因此培养基中的蛋白质在菌体生长过程中将会被分解，从而出现透明圈。
2.1.3 芽孢染色结果 如图2所示，zjoub-1菌株、zjoub-2菌株和zjoub-3菌株的芽孢在油镜下分别呈蓝紫色、蓝紫色和红色，且均为杆状，可知zjoub-1菌株和zjoub-2菌株为革兰氏阳性菌，zjoub-3菌株为革兰氏阴性菌。由此可知，zjoub-1菌株、zjoub-2菌株及zjoub-3菌株均为芽孢杆菌。zjoub-1菌株的菌体大小比zjoub-2菌株大。
2.2 蛋白酶活力
L-酪氨酸标准曲线如图3所示。3株菌株中，透明圈法测得的酶活力大小依次为zjoub-1>zjoub-2>zjoub-3。福林酚试剂法测得发酵液酶活力的大小依次为zjoub-1（46.73 U/mL）>zjoub-2（24.79 U/mL）>zjoub-3（19.26 U/mL）。因此，选出蛋白酶活力最强及透明圈（H/C）值最大的菌株zjoub-1进行下一步分子鉴定。
2.3 zjoub-1菌株的分子鉴定
2.3.1 16S rRNA基因PCR扩增 zjoub-1菌株16S rRNA基因PCR扩增结果如图4所示，得到条带大小为2 000 bp。
2.3.2 16S rRNA基因测序和菌种鉴定 对菌株zjoub-1的16S rRNA基因测序，将菌株zjoub-1的16S rRNA基因序列在NCBI官网中使用Nucleotide BLAST比对，选取该菌种使用MEGA软件构建系统发育树，如图5所示。图中数字“3”为zjoub-1菌所在位置，由系统发育树分析可得出zjoub-1菌株为枯草芽孢杆菌，与zjoub-1菌株芽孢染色结果相符合。
2.4 枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响因素
2.4.1 发酵温度对枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响 发酵温度是影响蛋白酶活力的重要因素之一。由图6可知，随着发酵温度的升高，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力也逐渐上升。当发酵温度为37 ℃时，金枪鱼暗色肉发酵后枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高，为47.31 U/mL。
2.4.2 发酵时间对枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响 由图7可知，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力随着发酵时间的延长而增加，但48 h后蛋白酶活力呈下降趋势，可能是因为S着发酵的进行，营养物质被消耗，营养物质的缺乏影响微生物代谢的活动，大大减少蛋白酶的生成。当发酵时间为48 h时枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高，为47.93 U/mL。
2.4.3 接种量对枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响 由图8可知，接种量的增加可以明显提高菌株产蛋白酶活力，当接种量为2%时，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高，为48.25 U/mL。
2.4.4 pH对枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力的影响
由图9可知，随着pH的升高，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力也逐渐升高，当pH为7.4时，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高，为49.21 U/mL，随后枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力随着pH的升高而下降。
3 讨论与结论
金枪鱼下脚料的原料主要为熟制后的暗色肉，脂肪含量相对较高，这一特性导致采用传统的鱼粉加工工艺很难生产出高质量的饲料产品[13，14]。因此，对金枪鱼下脚料进行深度开发，提高其利用率和附加值显得尤为迫切。目前，对于金枪鱼暗色肉等下脚料的高值化加工利用主要通过酶解法制备饲料肽，对金枪鱼暗色肉的微生物发酵研究较少。研究表明，采用微生物发酵制备小肽能够将暗色肉中的大分子蛋白降解成小分子肽，同时有效抑制杂菌生长、降低组胺的生成，有效提高发酵暗色肉产品中的肽含量，提高金枪鱼暗色肉蛋白质消化率，从而改善其营养价值，对弥补中国蛋白饲料尤其是优质蛋白资源的短缺，提高金枪鱼下脚料利用率具有现实意义。常用的蛋白饲料发酵菌种包括酵母菌、霉菌、枯草芽孢杆菌及乳酸菌等，其中枯草芽孢杆菌作为益生菌能通过提高免疫力、调节肠道菌群、防止腹泻等作用，促进动物生长，提高生产性[15-17]。因此，分离筛选能分泌具有良好酶学特性并适用于金枪鱼暗色肉发酵大规模生产应用的蛋白酶高产菌株具有较大的应用价值。 此外，微生物的培养是一个复杂的过程，其产蛋白酶活力的高低受很多因素的影响，如发酵时间、接种量、温度、pH等，因此对其发酵条件的优化显得尤为重要[18]。菌株生长一定时间后，菌群会大量繁殖，金枪鱼暗色肉中营养物质的消耗速度加快，到了发酵后期，金枪鱼暗色肉中的I养物质不能满足菌株产蛋白酶的要求，所以蛋白酶活力也相对降低了。延长发酵时间一方面可以使菌群大量繁殖从而达到稳定生长期，但在后期也可能产生不利的影响。综上所述，发酵时间对枯草芽孢杆菌发酵金枪鱼暗色肉有较大的影响，故选取48 h为最适宜的发酵时间。接种量影响菌株在金枪鱼暗色肉发酵中的生长、代谢、繁殖的速度。选定适宜接种量可以缩短发酵体系内菌体密度达到高峰的时间，有利于产物的形成及发酵基质的利用，并减小被杂菌污染的几率。接种量过大会导致发酵体系溶氧不足，菌株生长缓慢，且易衰老，不利于发酵的进行；接种量过小则会延长发酵周期，影响最终产率。本试验中接种量为2%时，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高。温度主要影响微生物产酶的活力，从而影响其生长和代谢。发酵温度过高会缩短菌株生长周期，导致其过早老化，使得金枪鱼发酵产物产生不良的腐败风味。本试验研究表明，发酵温度为37 ℃时，枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力最高。只有适宜的pH才能满足菌株的生长需要，因为pH可影响酶活性、菌体细胞的结构及菌体对营养物质的吸收，从而影响菌体的生长和反应活性。本试验中枯草芽孢杆菌在pH为7.4时，产蛋白酶活力最高。
本研究通过富集培养、分离纯化，从舟山普陀白山的土壤中筛选出1株高产蛋白酶活力的zjoub-1菌株，平均透明圈（H/C）值为3.68，蛋白酶活力为46.73 U/mL。经16S rRNA基因测序以及MEGA软件构建系统发育树得出该菌株为枯草芽孢杆菌；对zjoub-1菌株的培养条件进行优化，当接种量为2%、pH为7.4、温度为37 ℃、发酵时间为48 h时，该菌株产蛋白酶活力最高，培养条件均最优时，蛋白酶活力可达49.21 U/mL，为金枪鱼暗色肉的发酵提供了良好的基础。
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