关键词：异养硝化；节杆菌属（Arthrobacter）；产碱杆菌属（Alcaligenes）；无色杆菌属（Achromobacter）；芽孢杆菌属（Bacillus）
Key words：Heterotrophic nitrification；Arthrobacter；Alcaligenes；Achromobacter；Bacillus
随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，未经适当处理的含氮废水，如生活污水、工业、种植业及禽畜养殖业废水等，大量排放入江河湖泊，造成了越来越严重的水体富营养化问题，危害到农业、渔业、旅游业等诸多行业，对饮水卫生和食品安全也构成了巨大威胁。近年来，国内外在脱氮微生物菌株的筛选和培育研究方面非常活跃，一些异养硝化菌、好氧反硝化菌、自养反硝化菌、厌氧氨氧化菌等非传统脱氮微生物不断被发现[1-4]，为研究开发经济有效的氮污染物净化技术提供了新的理论和思路。
异养硝化菌是指在好氧条件下能将氨氮或还原态有机态氮氧化成羟胺、亚硝酸盐和硝酸盐的一类微生物[5]。异养硝化微生物的发现，是对传统硝化理论的丰富与突破，特别是一些异养硝化微生物同时具有好氧反硝化的特性，可实现同步硝化反硝化的全新脱氮工艺[6]。因此，异养硝化微生物的重要性日益受到关注[7-10]。
异养硝化微生物种类繁多，分布于藻类、放线菌、真菌和细菌中[7]。由于其遗传背景的差异性，不同的异养硝化微生物的生长及硝化特点都有所不同[6]。并且异养硝化菌可以利用的基质范围广泛，如铵、胺、酰胺、N-烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等，这使得异养硝化机理到目前仍不清楚，其代谢途径也未被确定和证实[11]。从自然环境中分离不同的异养硝化菌，对研究异养硝化途径和异养硝化微生物多样性，以及开发新型高效脱氮工艺具有重要意义。为此，本研究通过四级富集培养法从生活污水排放渠中分离筛选高效异养硝化细菌，分析其多样性，为异养硝化菌的理论研究和应用研究提供材料。
1 材料和方法
1.1 环境样品
采集排污沟渠距水面10 cm处的水样以及其附近10 cm深度的土样。采样后立即用于异养硝化细菌的筛选。
牛肉膏蛋白胨培养基（pH 7.2）：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，补充去离子水至1 L。固体培养基添加1.5%的琼脂。用于菌株的形态观察、保存及活化。
1.3 异养硝化菌的筛选
1.4 菌株的多样性分析
1.5 氨态氮（NH4+-N）的检测
定性检测：取600 μL待测样品于比色板上，滴加50 μL钠氏试剂，呈黄色，则培养液中含氨氮，颜色越深，氨氮含量越高。
定量检测：采用国家环境保护标准《水质氨氮的测定―钠氏试剂分光光度法》（HJ 535-2009）。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离纯化
2.2 菌株的筛选
2.3 菌株的氨氮去除率
将筛选得到的6株异养硝化能力较强的菌株接种于液体异养硝化培养基中，30 ℃ 60 r/min摇床培养48 h， 检测氨氮浓度的变化， 结果显示6株菌株的氨氮去除效果较好（表2），氨氮去除率为76.6%～99.2%。
2.4 菌株的多样性分析
传统氮循环理论认为，执行硝化作用的微生物是一群生长缓慢的化能自养型硝化细菌[10]。自1949年Quastel等[15]以丙酮肟作为选择性培养基，首次分离获得异养硝化菌株以来，异养硝化微生物和异养硝化作用引起研究者们的广泛关注。研究发现，与自养硝化细菌相比，虽然异养硝化细菌单位菌体的硝化活性低，但其生长速率快，在有大量有机物存在条件下，对氧气和营养物的竞争比自养细菌强，容易成为优势菌，而且异养硝化细菌对高浓度氨氮的耐受性强[10，16]，因此异养硝化细菌对污水中氨氮的净化作用不可小觑。
本研究在富集培养异养硝化细菌时，用生长曲线指导富集培养的时间，在对数生长结束后立即进行转接，使自养硝化菌来不及充分生长而快速被淘汰，从而增加分离异养硝化菌的成功率。在初筛时，以钠氏试剂为指示剂对氨氮进行定性检测，在操作上简单快速，可大大提高筛选效率。
参考文献：
[2] KHARDENAVIS A A， KAPLEY A， PUROHIT H J. Simultaneous nitrification and denitrification by spanerse Diaphorobacter sp[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 77（2）： 403-409.
[3] KIM J K， PARK K J， CHO K S， et al. Aerobic nitrification-denitrification by heterotrophic Bacillus strains [J]. Bioresource Technology， 2005， 96（17）： 1897-1906.
[5] 何 霞，赵 彬，吕 剑，等.异养硝化细菌Bacillus sp. LY脱氮性能研究[J]. 环境科学，2007，28（6）：1404-1408.
[6] 苟 莎，黄 钧.异养硝化细菌脱氮特性及研究进展[J].微生物学通报，2009，36（2）： 255-260.
[7] 何 霞，吕 剑，何义亮，等.异养硝化机理的研究进展[J].微生物学报，2006，46（5）：844-847.
