关键词：苎麻纤维；纤维素酶；16S rRNA；Bacillus cereus
Isolation and Identification of Highly Efficient Degrading Strain of Cellulose in Ramie
WANG Chao-qun，CHEN Hong-gao，ZHANG Yun-peng
（School of Environmental Engineering， Wuhan Textile University，Wuhan 430020， China）
Key words： ramie fiber； cellulase； 16S rRNA； Bacillus cereus
纤维素酶（CMC）是实现纤维素降解的关键酶，只有纤维水解成了可溶性糖，才能被微生物发酵转化成生物能源[3]。由于真菌纤维素酶不如细菌纤维素酶那么复杂，容易分离纯化，目前主要用真菌来生产纤维素酶，如木霉、曲霉、青霉、根霉和漆斑霉等[4]。然而，细菌纤维素酶也具有其独特的优势，如：细菌生长较快，比真菌更容易重组出较高产率的纤维素酶；细菌纤维素酶虽然复杂但同时也赋予其更多功能，在降解纤维时能够很好地协作；细菌纤维素酶比真菌纤维素酶更能适应酸、碱、热、盐等极端环境，具有更广泛的工业应用前景。因此，细菌纤维素酶最近正受到越来越广泛的关注[5]。研究较多的产纤维素酶细菌主要有Bacillus subtilis、Clostridium
acetobutylicum、Clostridium thremocellum和Pseud-ononas cellulose，关于Bacillus cereus降解纤维的报道并不多见。
本研究从腐烂苎麻秆堆中筛选出1株高效降解苎麻纤维的微生物，优化其发酵条件，研究其产酶特征，鉴定其种属，为苎麻生物量的高效利用探索途径。
1 材料与方法
1.1 材料
苎麻纤维发酵培养基：苎麻纤维20 g/L，酵母膏 4 g/L，NH4NO3 4 g/L，MgSO4・7H2O 0.2 g/L， KH2PO4 4 g/L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。（将除苎麻纤维之外的部分配成溶液储存，灭菌的苎麻纤维临用时加入。）
水解圈试验：挑取分离得到的单菌落点种于CMC-Na筛选培养基上，42 ℃恒温培养3 d，用1 mg/mL的刚果红溶液染色平板30 min，再用蒸馏水清洗，最后用1 mol/L NaCl溶液脱色30 min，以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选标准，挑选比值较大的菌再进行划线分离，镜检确认为纯的单菌落后，接种于牛肉膏蛋白胨培养基上保存。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离
2.2 菌株的形态特征
菌株J04呈革兰氏阳性，直杆菌（图1a），菌落成短或长链排列。芽孢圆形，孢囊无明显膨大。菌落扁平，圆形或近似圆形，灰白色，不透明，边缘不规则，略有光泽，中部略凸起，表面较粗糙，似融蜡状（图1b）。
2.3 菌株发酵的最适温度与初始pH
菌株J04在CMC-Na发酵培养基中42 ℃振荡培养，经过约18 h的缓慢生长期后，开始进入对数期生长（图3）。整个对数生长期经历了大约54 h，然后进入稳定期。累计培养108 h后，菌群密度开始呈现出下降趋势。
2.5 CMC酶活与纤维降解效果
将J04接种到苎麻纤维发酵培养基中，42 ℃培养至2 d结束时检测到纤维素酶活开始上升，在持续急剧上升3 d（第五天）后接近最大值（24.3 U/mL），（图4）。纤维的降解速率与发酵体系中纤维素酶的变化密切相关，发酵2 d时检测到有大约2.6%的纤维被降解，此后随着纤维素酶活的持续上升，纤维降解速率明显加快，在第六天结束时累计降解18.8%，第八天结束时累计降解45.1%，表明菌株J04有较强的降解苎麻纤维的能力。
2.6 菌株的16S rRNA基因鉴定
3 讨论
苎麻是中国传统的多年生宿根纤维作物，对土壤和肥水要求低，适宜种植区域广泛，每公顷年产干物质22.5 t以上，因而资源比较优势十分突出。然而，目前苎麻总生物量中只有10%左右（韧皮纤维）被有效利用，70%左右（麻秆和麻叶）被废弃。麻秆和麻叶均含有丰富的纤维成分，因此，苎麻纤维降解高效菌的开发，对于促进苎麻纤维加工废弃生物质的资源化利用具有十分重要的意义。
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