摘要：直接用纯种菌体在适当条件下培养得到菌体，消除了生物菌体混入杂菌的影响。通过正交试验得出海藻酸钠固定化鞘氨醇单细胞小球对ＣＯＤ降解的最佳条件；讨论了时间、温度、ｐＨ值、降解剂用量、摇床摇速几个单因素对海藻酸钠固定化鞘氨醇单胞菌小球降解ＣＯＤ的影响；通过比较可以得出在降解ＣＯＤ的过程中，微生物只有借助某一载体才能表现出其最佳降解活性，微生物包埋法具有操作简单，效果明显，污染少，成本低等优点。
关键词：降解；海藻酸钠；固定化；鞘氨醇单胞菌；ＣＯＤ
中图分类号：Ｘ７１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－1975-05
Study on the COD Degradation of Cultured Seawater in Liangyungang by Sodium Alginate Immobilized Sphingom onas
ＣＨＥＮ Ｗｅｎ－ｂｉｎａ，ｂ，ＹＩＮ Ｌｅｉｂ，ＭＡ Ｗｅｉ－ｘｉｎｇｂ，ＸＵ Ｘｉｎｇ－ｙｏｕｂ，ＫＯＮＧ Ｊｕｎｂ
（a． Ｊｉａｎｇｓｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ； b．College ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Jiangsu， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｎｅｗ ｔｈａｌｌｉ ｃｏｕｌｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ immobilized Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ degradation ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ ｐｅｌｌｅｔ ｔｏ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｉｍｅ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｐＨ value， ｔｈｅ degradation reagent dosage ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈａｋｅｒ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ degradation ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎｌｙ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｖｅｃｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＯＤ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ｍｉｃｒｏ－ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｈａｄ ｍａｎｙ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ， ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ， ｌｅｓｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ， ｌｏｗ ｃｏｓｔ， ｅｔｃ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ； ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ； Ｓｐｈｉｎｇｏｍ ｏｎａｓ； ＣＯＤ
连云港近海海域污水、废渣、废油和化学物质源源不断地流入大海以及海水养殖业的发展使得海水水质恶化，赤潮等海水变质现象的发生让社会认识到海水修复技术的重要性。海水修复技术有物理修复法、化学修复法和生物修复法等［１］。化学修复法由于投加化学试剂，因此费用高且易产生二次污染［２］。物理修复法易于操作，处理效果明显，但往往治标不治本［２］。微生物固定化修复技术的主要特点是对完整的微生物细胞进行固定，可避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性，可提高单位体积水体内微生物细胞密度，并可加快细胞的流动速率，能有效地解决污染环境修复问题［３］。固定化后的微生物能长期保持活性，固定化颗粒可重复使用，节省投资，固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中和激烈的操作条件下可稳定地发挥高效性能［４］。将固定化细胞颗粒直接投加到其中，操作简单，不产生二次污染，节省投资，简化流程［５］。而有关海水养殖环境生物修复技术的研究，国内外刚刚起步，微生物修复是当前污染环境生物修复的主要形式。于伟君［６］等研究表明光合细菌能降低虾池水中有害物质、氨氮的含量，对改善虾池生态环境有明显的效果。莫照兰等［７］在实验室条件下筛选到对虾池富营养有机物具有较高降解性能的细菌，包括弧属、假单胞属、发光杆菌属等，试验结果表明这些细菌对消化虾池残饵、粪便的处理效果很明显。研究从海洋底泥中筛选出的鞘氨醇单胞菌菌株ＲＢ２２５６使用海藻酸钠固定后对污染的养殖海水进行生物修复，对海水中的ＣＯＤ进行降解，通过单因素试验和正交试验得出ＣＯＤ的最佳降解条件和各单因素对ＣＯＤ降解影响的大小，可为污染海水的生物修复提供理论依据和实践参考。
１材料与方法
１．１主要仪器与试剂
ＷＦＪ－７２００型可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；ＴＤＬ－４飞鸽系列离心机（上海安亭科学仪器厂）；ＳＷ－ＣＪ－１Ｄ型无菌操作台（苏州净化设备有限公司）；ｐＨSＪ－５型实验室ｐＨ计（上海树立仪器仪表有限公司）；ＳＨＰ－１８０生化培养箱（上海雷磁仪器厂）；ＨＺＱ－ＱＸ型全温振荡器（上海实验仪器总厂）；立式压力蒸汽灭菌器（哈尔滨东联电子技术有限公司）。
氯化钙溶液：２０ ｍｇ／Ｌ，称取２０ ｇ氯化钙溶于水中，移入１ ０００ ｍＬ容量瓶内，稀释至标线，摇匀。
１．２海藻酸钠固定化鞘氨醇单细胞小球的制备
试验以连云港赣榆县某养殖场海水为样品，此海水样的初始ＣＯＤ浓度为２０．５0 ｍｇ／Ｌ。
１）配制２％（质量体积分数）海藻酸钠－鞘氨醇单胞菌混合液（１ ｇ海藻酸钠加入５０ ｍＬ培养好的菌液）。
２）用注射器吸取海藻酸钠－鞘氨醇单胞菌混合液，慢慢加入ＣａＣｌ２溶液中，老化４ ｈ。
３）倾去ＣａＣｌ２溶液，用去离子水洗涤海藻酸钠固定化鞘氨醇单胞菌小球至少３次（以洗涤液中不含Ｃａ２＋为准）。
１．３试验方法
１．３．１正交试验设计试验设计有温度、小球质量、ｐＨ值、时间４个因素，分别记为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ，每个因素设４个水平，采用４因素４水平的正交表将试验分为１６个处理组，其中Ａ１． ３７ ℃、Ａ２．３０ ℃、Ａ３．２０ ℃、Ａ４．１０ ℃；Ｂ１．０．９ ｇ、 Ｂ２．１．０ ｇ、 Ｂ３．１．１ ｇ、 Ｂ４． １．２ ｇ；Ｃ１． ｐＨ值４、Ｃ２． ｐＨ值５、Ｃ３． ｐＨ值６、Ｃ４． ｐＨ值７；Ｄ１． ９０ ｍｉｎ、Ｄ２．１００ ｍｉｎ、Ｄ３．１１０ ｍｉｎ、Ｄ４．１２０ ｍｉｎ，每处理３次重复。海水样品为10 mL。 １．３．２单因素试验分别考察了温度、小球质量、ｐＨ值、时间、摇床转速对海藻酸钠固定化鞘氨醇单胞菌小球降解ＣＯＤ的影响。
１．３．３比较试验考察了鞘氨醇单胞菌包埋与否对ＣＯＤ降解的影响。
１．３．４试验步骤用所取海水水样调节不同ｐＨ值，加入降解剂海藻酸钠固定化鞘氨醇单胞菌小球，至上述Ａ因素中不同温度的摇床中，振荡Ｄ因素中的不同时间，待振荡时间结束，过滤，测降解后海水中的ＣＯＤ。
２结果与分析
２．１正交试验结果与分析
由测得的降解后海水ＣＯＤ的值计算出降解剂的降解量和降解率，其数据见表１。由表１可以看出，降解量中极差最大的是Ｃ，其次是Ｄ、Ａ、Ｂ，说明ｐＨ值对降解量的影响最大；再得出降解率中的极差大小与降解量的顺序一致，也是Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，说明ｐＨ值对降解率的影响最大。吸附率的方差分析如表２。由表２可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ对吸附率的影响极显著，结合表１各因素对吸附率影响的主次顺序为Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，则最优方案为Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ１，即在ｐＨ值为６，振荡９０ ｍｉｎ，３７℃，小球质量为０．９ ｇ时吸附效果最佳。吸附量的方差分析如表３。由表３可知，因素Ａ、Ｃ、Ｄ对吸附量的影响极显著，结合表１各因素对吸附量影响的主次顺序Ｃ＞Ｄ＞Ａ＞Ｂ，则最优方案为Ｃ３Ｄ１Ａ１Ｂ４，即在ｐＨ值为６，振荡９０ ｍｉｎ，３７℃，小球质量１．２ ｇ时吸附效果最佳。
２．２ 单因素试验结果分析
２．２．１时间、温度与降解量之间的关系试验中时间试验拟定静置与振荡两种情况，取５个２５ ｍＬ锥形瓶向其中加１０ ｍＬ海水，再向其中加入１．０ ｇ降解剂，在３７℃水浴中不同时间测ＣＯＤ，其结果见图１。从图１中看出，两种情况下以振荡时降解效果最佳，主要是由于振荡时整个溶液内还原性物质是均匀分布的，降解速度均匀；静置时小球降解还原性物质是呈局部状态的，速度时快时慢。开始时降解速度较快，接下来降解速度相对变慢，到最后还出现降解量下降的现象。这主要是由于起初小球内部积累的还原性物质浓度较低，随时间变化，小球内部还原性物质的浓度增大，使降解速率减小［８］，当降解量达到最大后，小球内部的还原性物质被解析出来，降解量出现下降的现象。由图２可以看出，在相同的时间内，温度越高，降解量就越大，这主要是由于降解反应是一个吸热过程，温度越高，越有利于降解的进行。但是超过一定温度后，降解效果变差，主要是由于微生物的活性是在一定温度下表现出来的，超过或低于此温度酶的活性降低，小球的降解率性能下降［９，１０］，降解效果达不到最佳。
２．２．２降解剂量、ｐＨ值对降解性能的影响由图３可以看出，增加降解剂的量可以提高降解性能，但加入过多也会降低降解性能。原因是由于降解剂的解析作用；另一方面是由于降解体系中溶质与溶剂相互作用，从而使降解性能下降［５］。
从图４中可以看出，当ｐＨ值为７左右时降解效果较佳。随着ｐＨ值的增大，降解性能呈现下降的趋势，这可能是由于在较强酸的条件下，Ｈ＋的浓度较大，结合了细菌表面的负电荷，使降解剂表面的负电荷减少，从而使其降解还原性物质的能力减小，因此其降解性能也差。另外，微生物只有在最佳ｐＨ值下，其体内的酶活性最大，ｐＨ值或高或低都会影响酶的活性，因此不在最佳ｐＨ值下时，酶的活性降低，降解性能也会下降［１１，１２］。
２．２．３摇床转速、不同生长时期细菌对降解性能的影响由图５看出，随转速增加，降解量和降解率先增加后减少，因为改变转速影响溶氧和水中微生物的接触情况。低转速会导致供氧不足，限制微生物对还原性物质的去除，使水与微生物不能充分接触；提高转速会导致微生物之间的摩擦增加，造成微生物磨损，不易降解还原性物质［１３］。
由图６可知，培养２４ ｈ的微生物做成的小球的降解量与降解率最大。这是由于培养２４ ｈ的微生物正处于活性最强的对数期，而选用的其他培养时间的微生物处于微生物生长繁殖的其他３个时期，其活性不如对数期，因此，选用培养２４ ｈ的微生物做成小球的降解量与降解率比选用其他培养时间的大［１０］。
由此可见，对ＣＯＤ降解起主要作用的还是微生物，海藻酸钠作为一种天然高分子物质具有生物降解性和生物相容性，由于其结构中含有降解性官能团，其对ＣＯＤ降解起一定的作用［１４］。微生物降解ＣＯＤ的机理可能分为两个阶段：第一阶段与代谢无关，为生物降解过程，在此过程中，水样中的还原性物质可能通过配位、螯合、离子交换、物理降解及微沉淀等作用中的一种或几种复合至细胞表面。在此阶段中微生物的作用较快；第二阶段为生物累积过程，在此阶段中还原性物质被运送至细胞内。生物累积过程和细胞代谢直接相关［１４，１５］。
综上所述，在３７℃、１．０ ｇ降解剂、ｐＨ值为7左右、振荡时间9０ ｍｉｎ、摇床转速１１５ ｒ／ｍｉｎ时，效果较佳。达到国家规定海水质量标准中的二类海水水质标准，符合养殖海水标准（清洁海水ＣＯＤ≤２ ｍｇ／Ｌ，较清洁海水ＣＯＤ≤３ ｍｇ／Ｌ，轻微污染海水ＣＯＤ≤４ ｍｇ／Ｌ，中度污染海水ＣＯＤ≤５ ｍｇ／Ｌ）。
３结论
通过海藻酸钠固定化鞘氨醇单胞菌对海水ＣＯＤ降解的试验，在摇床转速、温度、ｐＨ值、降解剂质量因素中，ｐＨ值对海水ＣＯＤ降解的影响最大。其中，温度是一个较主要的因素。由于降解反应是一个化学过程，所以降解量和降解率会随着温度的升高而增大；ｐＨ值同样也是一个影响因素，试验中降解量和降解率随着ｐＨ值的升高先升后降，一般ｐＨ值为7左右，降解效果较佳；培养24 h的微生物做成的小球降解效果最好。处理后的海水达到国家规定海水质量标准中的二类海水水质标准，符合养殖海水标准。中国wwW.LWlm.com
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