关键词：荧光假单胞菌；低温噬茵体；分离；特性
中图分类号：093
文献标识码：A
目前分离到的低温噬菌体主要是从污水、冰箱、表层海水与海底沉积物、海冰等环境中分离出来的[3，5]。明永冰川位于我国生物多样性丰富的三江并流地区，属于梅里雪山山系，是全球罕见的低纬度、低海拔、季风海洋性冰川[6]。本文从明永冰川土壤样品中分离、纯化获得一株低温假单胞菌的噬菌体，并对其生物学特性进行了初步研究。
1材料与方法
1.1 样品采集
采样地点位于云南省明永冰川冰舌地区（N28°27′，E98°48'）。取冰舌地区不同地点冰泥样品3份，用密封袋密封好，样品在被运回实验室后置于4～8℃保存。
LB培养基，pH7.0。固体培养基的琼脂浓度为2%，半固体培养基的琼脂浓度为0.6%。
1.3低温宿主茵及其噬菌体的分离
低温宿主菌的分离采用稀释涂布平板法，取不同采样点土壤样品2g于100mL无菌水中震荡，土壤悬浮液梯度稀释涂布LB固体平板，置于15℃恒温培养箱培养3～4d，划线纯化获得纯菌株作为噬菌体分离的宿主菌。
1.4宿主菌的16S rRNA基因扩增及测序
1.5噬菌体的形态观察
1.6宿主菌生长温度范围及一步生长曲线测定
1.7低温噬菌体特性研究
1.7.1噬菌斑形成温度范围实验
噬菌体一步生长曲线测定采用Lu[8]的方法.
1.7.3最佳感染复数的测定
最佳感染复数的测定参照Lu[8]等的方法。按照感染复数分别为0.001、0.01、0.1、1和10的比例分别将噬菌体纯培养液加入到含对数期宿主菌的试管中，15℃，170r/min培养3.5h，10000g离心10min，收集上清作连续梯度稀释，测定噬菌体滴度，作双份取平均值；同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体作为对照。
1.7.4热稳定性测定
将滴度稀释至为lxl07pfu/mL的噬菌体悬液1mL置于40、50、60、70℃水浴锅中，每隔5min取样，测定噬菌体滴度变化。
1.7.5有机溶剂耐受性
1.8噬菌体DNA的提取及限制性酶切片段分析[9]
1.9噬菌体蛋白组成分析[9]
2结果
2.1低温茵及其裂解性噬菌体的分离
从低温的冰川样品中分离到约100株细菌，且大部分为假单胞菌，这与以前在同一取样点分离的结果相似[l0]，分离、纯化获得一株低温噬菌体。噬菌斑透明、边缘清晰、圆形，直径约5mm，出斑时间约10h，表现为明显的裂解性噬菌体噬斑特征。
宿主菌16S rRNA基因序列同源检索分析表明其与荧光假单胞菌同源性最高，达到99%，因此将其初步鉴定为荧光假单胞菌菌株。
2.2低温噬菌体形态观察
噬菌体为球形，直径约50nm，外壳的中间比较亮，说明内部是空的，根据形态初步判断为覆层噬菌体科噬菌体。
2.3宿主菌生长温度范围及一步生长曲线
宿主菌可在4～28℃生长，属于耐冷菌，与典型的荧光假单胞菌性质相似。
从图2可以看出宿主菌在第9h开始进入对数期，对数期一直持续到第22h，菌体浓度到达高峰值，以后进入稳定期。
2.4低温噬菌体特性研究
2.4.1噬菌体生长范围实验
2.4.2噬菌体的一步生长曲线
噬菌体吸附宿主菌后进行培养的不同时间取样，测定上清液中噬菌体滴度（图3）。
从图3可以看出噬菌体的潜伏期约为60min，裂解期大约为20min，噬菌体的潜伏期与噬菌体、宿主菌及环境条件都有关，不同噬菌体于同一菌株生长，或相同噬菌体于不同宿主菌生长，潜伏期都不同。
根据公式：爆发量=爆发末期噬茵体滴度/初期被感染宿主菌浓度，计算得出PFV1的爆发量为10。
2.4.3噬菌体最佳感染复数
对数期宿主菌浓度为9xl09/mL，噬菌体原液中噬菌体滴度为lxl010pfu/mL。噬菌体和宿主菌混合培养3.5h后，宿主菌被充分裂解，培养液变得澄清，计数各测定管中噬菌体滴度（表1）。
根据表1，当MOI=1时噬菌体感染其宿主产生的子代噬菌体数量最多，可以达到9.8xl010pfu/mL，因此确定噬菌体在以假单胞菌为宿主时的最佳感染复数为1。
2.4.4噬菌体热稳定性测定
2.4.5有机溶剂耐受性
荧光假单胞菌噬菌体对氯仿具有一定的敏感性，氯仿处理后只保留65%的滴度，推断噬菌体病毒粒可能含脂类物质，因此，造成了其对氯仿具有一定敏感性。
2.5限制性酶切片段长度多态性分析
分离到的低温噬菌体的基因组为双链DNA，可以被HindⅢ、EcoR I、BamH I和Pst I切成多条大小不等的片段，进一步分析表明其基因组DNA大小约38kb（图4）。
2.6噬菌体衣壳蛋白组成分析
3讨论
低温嗜菌体的研究不仅可以丰富和发展对生命形式的认识，而且在构建低温菌表达系统的人工载体和开发低温下高活性的工业用酶以及分子生物学工具酶等方面，都有着广泛的应用前景。
参考文献（ References）：
[3]MIDDELBOE M，GLUD R N，WENZHO FER F，et al.Spatialdistribution and activity of viruses in the deep-sea sedimentsof SAGAMI Bay， Japan[J].Deep Sea Research， 2006， 53（1）：1一13.
[5]DANOVARO R，DELL ANNO A.CORINALDESI C，et al.Major viral impact on the functioning of benthic deep-sea e―cosystems[J]. Nature， 2008， 454（7208）：1084-1087.
[7]MARTHA R J，CLOKIE A M.Bacteriophages： Methods andprotocols Volume l：Isolation， characterization and interaction[M].USA： Human Press， 2008.
