1 引言
人类和动植物在依赖有益细菌、真菌的同时, 也遭受着有害细菌、霉菌等微生物的威胁. 它们能使各种工业原材料、食品、化妆品、医药品乃至生活垃圾等分解、变质、劣化、腐败, 严重损害人类的健康并带来重大的经济损失. 因此, 具有抗菌和杀菌功能的产品受到越来越多的关注.
无机抗菌剂克服了传统有机抗菌剂高温稳定性差、易产生耐药性、抗菌范围窄且有二次污染等缺点. 无机抗菌剂主要有金属离子型和氧化物光催化型两类, 其中金属离子型无机抗菌剂是将具有抗菌功能的金属离子(如 Ag+)加载在各种天然或人工合成的无机矿物载体上, 利用载体缓释抗菌离子, 达到抗菌的作用; 而氧化物型抗菌剂则利用光催化型材料(如 TiO2和ZnO等)在光催化下, 将吸附在表面的OH和 H2O 分子氧化成活性氧自由基(reactive oxygenspecies, ROS), 对环境中的微生物具有抑制和杀灭作用. 目前, 对于光催化型材料抗菌剂的研究越来越多.
2004年, Novoselov 等利用机械剥离高定向热解石墨的方法得到了高纯度的石墨烯薄片, 丰富了碳家族, 掀起了石墨烯研究的热潮. 石墨烯（GE）是由单层 sp2杂化的碳原子以六边形紧密堆积而成的二维蜂窝状晶体, 是构成其他碳材料的基本结构单元.这种特殊的结构, 使其在热学、电学和力学等方面表现出很多优异的性能. 为了改善和拓展 GE 的功能特性, GE 基复合物包括有机复合物和无机复合物的研究和应用受到越来越多的关注, 在催化及电子传输等领域均具有广阔的应用前景. 然而, 关于 GE复合物材料在抗菌性能方面的研究报道较少.
2 实验部分
2.1 试剂
可膨胀石墨(EG)购于青岛南墅宏达石墨制品有限公司; 高锰酸钾(KMnO4)、浓硫酸(H2SO4, 98%)、浓磷酸(H3PO4, 85%)、过氧化氢(H2O2, 30%)、盐酸(HCl, 35%~37%)、氨水(NH3H2O, 25%~28%)、水合肼(N2H4H2O, 85%)、九水硝酸铁(Fe(NO3)39H2O)、六水硝酸锌(Zn(NO3)26H2O)等均为分析纯试剂, 购于国药集团化学试剂公司. 使用前未经进一步提纯.
2.2 样品的制备
2.2.1 GE 的制备
采用改进的 Hummer 方法制备氧化石墨（GO）.分别称取 1.5 g EG 和 9.0 g KMnO4至 500 mL 三颈烧瓶中, 搅拌混合均匀, 然后缓慢加入 180 mL 浓H2SO4和 20 mL 浓 H3PO4混酸, 并不断搅拌. 随着混酸的加入, 温度逐渐升高至 35~40℃, 50℃恒温水浴,搅拌 12 h. 待反应冷却至室温, 将反应物小心倒入盛有冰水的烧杯中, 加入 H2O2, 直至混合溶液呈金黄色. 将浆液分别用 30% HCl 洗涤除去 SO42+(用 Ba2+检验)和蒸馏水洗涤直至滤液呈中性. 储存浆料待用(含量约为 1 g GO/100 g 浆料), 并取少量浆料干燥用于样品表征.
2.2.2 ZnFe2O4和 GE/ZnFe2O4的制备
采用化学共沉淀法制备不同 GE 和 ZnFe2O4质量比(mG/Z)的 GE/ZnFe2O4二元复合物. 以 mG/Z= 0.4 为例, 称取 2.97 g Zn(NO3)26H2O 和 8.08 g Fe(NO3)39H2O溶解在 50 mL 蒸馏水中, 搅拌均匀; 将 0.96 g GE 分散在 100 mL 蒸馏水中, 不断搅拌下超声 1 h, 将分散均匀的 GE 悬浊液加入到上述硝酸盐溶液中, 搅拌混合至均匀; 随即向混合液中边搅拌边缓慢滴加 0.1mol/L NaOH 溶液(滴速为 1 滴/s 左右), 直至 pH 为9~10, 80℃回流 2 h, 冷至室温. 洗涤抽滤至滤液呈中性, 60℃干燥并研磨, 得到复合物粉体. 将粉体在空气气氛中 350℃下煅烧 3 h, 即得 mG/Z= 0.4 的GE/ZnFe2O4复合物. 按照上述过程制备 ZnFe2O4和mG/Z= 0.1、0.2 及 0.6 的 GE/ZnFe2O4复合物.
2.3 样品表征
用 Philps-Pw 3040/60 型 X 射线衍射仪(XRD, 帕纳科公司, 荷兰)扫描分析样品, 工作电压为 40 kV,工作电流为 40 mA, 扫描范围 2 = 20~80, Cu K 辐射( = 0.15405 nm), 扫描速率为 4 RM1000 型显微共焦激光拉曼光谱仪(Raman, Renishaw 公司, 英国)测试样品的拉曼光谱(激发波长 = 514 nm);NEXUS-670 型傅里叶红外光谱仪记录样品的红外光谱(FT-IR, Thermo Nicolet 公司, 美国, KBr 压片, 扫描范围为 400~4000 cm1); 用 STA 499C 型热分析仪(TG/SDT, Netzsch 公司, 德国)于空气气氛(30 mL/min)中以10 ℃/min 的升温速率在室温~800℃温度范围内测试样品的热重行为曲线; Hitachi S-4800 型扫描电子显微镜(SEM, 日立公司, 日本)和 JEOL-2010 型透射电子显微镜(TEM, 日立公司, 日本)观测产物的粒径分布和微观形貌.
2.4 抗菌性能测试
以 E. coli、S. aureus 和 C. albicans 为测试菌种,分别采用粉末压片抑菌圈法和试管二倍稀释法对样品的抑菌圈直径(inhibition zone diameter, IZD)和最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)进行测试.
2.4.1 培养基的制备
按照文献的方法分别制备固体、液体培养基,供培养菌种.
2.4.2 菌悬液制备
(1) 活化菌种: 取菌种划平板分离得单菌落, 用接种环取少量供试菌种接种于 5 mL 液体培养基中,在恒温摇床中培养 18 h (170 r/min, 细菌 37℃, 真菌28℃, 下同).
(2) 对数期菌悬液配制: 将活化后菌种用麦氏比浊法配成 0.5 麦氏比浊管(浓度约为 1.5 108CFU/mL), 用液体培养基稀释至 106后, 4℃保存, 备用.
2.4.3 IZD 实验
在超净工作台中将固体培养基、培养皿、酒精灯、玻璃涂布器和移液枪等在紫外灯下照射杀菌 30 min.在每个培养皿中倾注约为 15 mL 熔化的固体培养基制成平板. 待培养基固化, 移取200 L菌悬液注入到平板上, 并用涂布器涂布均匀. 将直径为 17.0 mm 的圆片样品(用 0.3 g 测试样品压制而成)置于平板中央,并以无菌滤纸片(直径为 17.0 mm)作阴性对照. 将培养皿置于恒温培养箱(日光灯照射强度分别为 150 Lx和 300 Lx)中培养 24 (36) h. 用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径, 每个样品进行 3 次平行实验,取其平均值.
3 结果与讨论
3.1 XRD 分析
EG、GO、GE、ZnFe2O4及不同 mG/Z的 GE/ZnFe2O4复合物的 XRD图谱如图 1所示. 由图 1(a)可看出, 在2 = 26和 42处为 EG 的特征峰, 分别对应(002)和(100)晶面. EG 被强氧化剂氧化后(图 1(b)), 其特征峰消失, 并在 2 = 10附近出现了归属于 GO (001)晶面的衍射峰, EG 的完整结构被破坏.
3.2 热重分析
GE、GE/ZnFe2O4复合物和 ZnFe2O4的热失重行为曲线如图 4 所示. 由图 4(c)可知, ZnFe2O4的失重很小, 小于 5%, 这源于吸附水的挥发和少量氢氧化物的分解. 在图 4(a)中, GE 的热分解可以分为两部分:室温~120℃之间的重量损失主要是吸附水等无机小分子的挥发; 120℃以上对应于 GE 的氧化分解, 至670℃分解完全, 残留物(积碳)几乎为零. GE/ZnFe2O4复合物(图 4(b))的热分解行为与 GE 类似, 可以分为两段过程: 第一段过程发生在 150℃以下, 主要为吸附水等小分子的失重; 第二段过程发生在 150~520℃之间, 直至失重完毕并达到恒重, 这主要是由于 GE的氧化分解, 残留物约为 80% (主要是 ZnFe2O4和积碳). 除去微量的 GE 残留物, 可以推断在复合物中ZnFe2O4的含量不低于 75%, 与该复合物的理论含量基本吻合. 此外, 结合 GE和 GE/ZnFe2O4复合物的失重曲线可以看出, 复合物的最大分解速率对应的温度(470℃)低于 GE (575℃), 这说明复合物的热稳定性比 GE 差.
3.3 样品的抗菌性能
各样品对不同菌种作用的 IZD 值 (一般培养条件为光照强度 150 Lx, 24 h). 纯 GE 几乎没有抑菌效果, 其抑菌圈直径和空白值相近, 但复合物对不同菌种的抑菌圈有不同程度的增加, mG/Z= 0.4 的复合物对3类菌株的抑菌性能最好. 由表1还发现, 对于同种菌株, 某些 GE/ZnFe2O4复合物的抑菌效果比纯ZnFe2O4差, 这可能是由于 GE 具有较大的比表面积,将培养基中的营养成分吸附在表面, 使得复合物抑菌效果降低[21]. 此外, 同一样品对不同菌种的抑菌作用不同, 对 C. albicans 的抑菌效果最好, 这与菌种的结构有关. 从表 1 还发现, 无光照射时(0 Lx, 24 h)样品几乎没有抗菌性能; 增加光照强度(300 Lx, 24 h)和延长光照时间(150 Lx, 36 h), 样品的抗菌性能没有实质性的提高. 这说明光照是光催化剂产生抗菌性能的必要条件, 且光照射的强度只要达到光催化剂的光吸收阈值, 催化剂表面即可产生 ROS, 起到抗菌作用.
4 结论
用氧化还原法和化学共沉淀法分别制备了GE及其 ZnFe2O4复合物. 结果表明, 复合物并不是两组分的简单混合, 其组分间存在一定的相互作用; 复合物的抗菌效果与 mG/Z有关, 其中, mG/Z= 0.4 的复合物抗菌性能最好, 对 E. coli、S. aureus 和 C. albicans 的MIC 分别为 25、25 和 12.5 g/mL, 且同一复合物对不同菌种的抗菌性能有较大的差异, 这和菌种本身的结构有关. 复合物抗菌性能是 ROS 氧化抗菌和纳米表面抗菌共同作用的结果, 其中以 ROS 氧化抗菌机理为主. 由于该复合物制备原料丰富、工艺简单、稳定性好、无污染, 且具有高效的抗菌效能, 是一类极具应用价值的无机抗菌剂.
