超声波辅助提取远东疣柄牛肝菌菌丝体色素研究
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株。远东疣柄牛肝菌，西南大学食用菌研究室分离保藏菌株。 1.1.3 主要仪器与试剂。SCIENTZ-ⅡD型超声波细胞破碎机，宁波新芝生物科技公司；UV-1800型紫外可见分光光度计，日本日立公司；5810R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；DZF-1B型真空干燥箱，上海贺德实验设备有限公司；FW80型高速粉碎机，河北齐家务科科学仪器厂；JA2003A电子精密天平，上海精天电子仪器有限公司；Thermo Moder 481型摇床，Fisher Scientific有限公司。葡萄糖、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（沸程60~90 ℃）均为国产分析纯。 1.2.1 菌丝体的制备。将保藏菌株接种至活化培养基上于27 ℃培养6 d，打取菌丝块于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，27 ℃、140 r/min培养60 h，以10%的接种量接到装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，27 ℃、140 r/min培养96 h。发酵液离心5 000 r/min、20 min，去离子水洗涤菌丝体2次，收集菌丝体，50 ℃真空干燥，粉碎至60目保存备用。 1.2.3 单因素试验。精确称取菌丝粉0.200 g，置于50 mL离心管中，加入适当的提取溶剂，超声波破碎提取，提取液离心5 000 r/min、20 min，取上清液稀释10倍，以提取剂为空白，以410 nm处的吸光度值评价提取效果。 （1）乙醇浓度对色素提取效果的影响。在液料比75 mL/g，超声波功率300 W，提取温度60 ℃，提取时间40 min，研究乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%时对色素提取效果的影响。 （3）超声波功率对色素提取效果的影响。在乙醇浓度90%，液料比75 mL/g，提取温度60 ℃，提取时间40 min，研究超声波功率分别为150、200、250、300、350、400 W时对色素提取效果的影响。 （5）提取温度对色素提取效果的影响。在乙醇浓度90%，液料比75 mL/g，超声波功率300 W，提取时间40 min，研究提取温度分别为30、40、50、60、70、80、90 ℃时对色素提取效果的影响。 2 结果与分析 2.1 提取溶剂及检测波长的选择 远东疣柄牛肝菌菌丝体色素易溶于蒸馏水、甲醇、乙醇、丙酮等强极性溶剂，部分溶于乙酸乙酯，在石油醚中几乎不溶。由图1可知，远东疣柄牛肝菌菌丝体色素溶液在近紫外光区374～376 nm有一吸收峰，在可见光区410~416 nm有一吸收峰，色素浓度与410 nm处吸收峰的峰高成正比，因此可根据色素溶液在410 nm处的吸光度值评价提取效果。在410～416 nm区域，甲醇的吸收峰最高，其次是乙醇的。由于甲醇有一定毒性，故采用乙醇作为该色素的提取溶剂。 2.2 单因素试验 2.2.2 液料比对色素提取效果的影响。从传质效率的角度看，液料比主要体现在影响固相主体和液相主体间的浓度差，即传质推动力[5]。由图3可知，色素溶液的吸光度值随溶剂质量的增加而增加，但液料比超过75 mL/g后则逐渐降低，可能是由于液料比的提高加强了传质推动力，但过量溶剂的稀释又降低了色素溶液的吸光度值。 2.2.3 超声波功率对色素提取效果的影响。由图4可知，超声波功率对色素提取效果的影响不大，随着超声波功率的增加，色素溶液的吸光度值略有升高，当超过300 W后，再提高超声波功率，色素溶液的吸光度值几乎不变，甚至还有降低的趋势。 2.2.4 提取时间对色素提取效果的影响。由图5可知，色素溶液的吸光度值随提取时间的增加逐渐增高，但达到一定时间后，延长提取时间提取效果反而下降。超声波提取时间过长降低提取效果的原因可能有2个方面：一是使有效成分发生分解，二是使粗提物中杂质含量增加[6]，因此提取时间在40 min左右为宜。 2.2.5 提取温度对色素提取效果的影响。由图6可知，提取温度在50～60 ℃时，色素溶液的吸光度值最大。这是由于提取温度较低时，色素提取速度较慢，提取温度提高提取速度加快，但提取温度过高，即超过60 ℃则可能使色素分解，吸光度值降低。 （下转第134页） 2.3 正交试验 正交试验结果如表2所示，影响远东疣柄牛肝菌菌丝体色素提取的主要因素的主次顺序为：B＞A＞E＞D＞C，即液料比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞超声波功率，最优组合为A4B2C4D4E3，按此组合进行验证性试验，色素溶液的吸光度值为0.621。因此，可以确定超声波辅助提取远东疣柄牛肝菌菌丝体色素的最佳工艺条件为：提取溶剂为90%乙醇、液料比75 mL/g、超声波功率400 W、温度60 ℃提取50 min。 3 结论与讨论 远东疣柄牛肝菌菌丝体色素呈黄色，易溶于蒸馏水、甲醇、乙醇、丙酮等强极性溶剂，部分溶于乙酸乙酯，在石油醚中几乎不溶，通过色素溶液的光谱试验确定其最大吸收波长为410 nm。 试验研究乙醇浓度、液料比、超声波功率、提取时间和温度对远东疣柄牛肝菌菌丝体色素提取效果的 影响，并通过正交试验确定影响超声波辅助提取色素的主要因素是液料比，最佳提取工艺条件为：提取溶剂为90%乙醇、液料比75 mL/g、超声波功率400 W、温度60 ℃提取50 min。色素的结构等问题还有待进一步研究。 4 参考文献 [2] 王向华，刘培贵.云南野生贸易真菌资源调查及研究[J].生物多样性，2002，10（3）：318-325. [3] 高锦明，沈杰，张鞍灵，等.远东疣柄牛肝菌的化学成分[J].有机化学，2003，23（8）：853-857. [4] 王俊儒.天然产物提取分离与鉴定技术[M].杨凌：西北农林科技大学出版社，2006. [5] 李大婧，宋江峰，刘春泉，等.超声波辅助提取黑豆皮色素工艺优化[J].农业工程学报，2009，25（2）：273-279.
