超声波辅助法提取凤尾草中黄酮类化合物的影响因素研究
摘要：采用超声波辅助法提取了凤尾草中的黄酮类化合物，研究了影响凤尾草黄酮类化合物提取的多种因素。试验结果表明，在提取温度为４０℃，提取时间为４０ ｍｉｎ且用60%（体积分数，下同）甲醇作为提取剂时提取率最高。
关键词：凤尾草；黄酮类化合物；影响因素 凤尾草，又称鸡爪草，属凤尾蕨科的小型陆生蕨，叶二型；不育叶为一回羽状复叶，羽片条形，上部羽片基部下延，在中轴两侧形成狭翅，下部羽片常有二至三叉，形似凤尾，故而得名［１］。凤尾草中全草含黄酮类、甾醇、氨基酸、内酯或酯类等生理活性成分，全草都可以供药用，它具有清热利湿、凉血解毒、强筋活络等功效［２］，能增强免疫力、延缓衰老等，无论在临床应用还是保健类食品开发方面都有广阔的开发前景。因此对凤尾草的研究和开发成为国内外目前的研究热点之一［３－５］。本试验从凤尾草黄酮类化合物提取影响因素方面进行了研究，为凤尾草的深入研究和天然药物的开发提供了一定的理论依据。 １材料与方法 １．１材料 凤尾草：采摘于江苏省宿迁学院院内墙角下。 １．２主要试剂和仪器 0.01 mol/L盐酸、60%甲醇、60%（体积分数，下同）乙醇、60%（体积分数，下同）丙酮，均为分析纯，纯品由国药集团化学试剂有限公司（上海）生产；芦丁标准品，由中国药品生物制品检定所提供。 ＵＶ－２１０２Ｃ型紫外－可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；ＦＡ２００４Ｎ电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；ＫＱ－２５０Ｂ型超声波清洗器；温控水浴锅；大孔吸附树脂。 １．３方法 １．３．１黄酮类化合物的提取称取１０.00 ｇ凤尾草样品，研磨破碎后，用60%甲醇按１∶１０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）的比例混合均匀，于４０℃下提取60 min后，在４０℃的水浴中超声波辅助提取３次，每次１０ ｍｉｎ，抽滤。收集到的滤液于４０℃下减压浓缩得到红色黏稠的粗提液，经树脂纯化、洗脱后，再次进行减压浓缩即得到黄酮类化合物浓缩液［６］，将浓缩液用0.01 mol/L盐酸和６０％甲醇配成ｐＨ值为３．０的备用液，摇匀供分析试验用。 １．３．２黄酮类化合物含量的测定芦丁标准储备液：称取０．０１０ ０ ｇ芦丁标准品，置于５０ ｍＬ的容量瓶中，加0.01 mol/L盐酸和６０％甲醇使其溶解［7，8］，调节ｐＨ值为３．０并稀释至刻度，摇匀备用。分别移取１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５ ｍＬ的芦丁标准储备液，于１０ｍＬ容量瓶中，定容。在波长５２０ ｎｍ处分别测定其吸光度，结果见图１。准确吸取待测凤尾草的提取液２．０ ｍＬ定容至５０ ｍＬ。在波长５２０ ｎｍ处测其吸光度。由标准曲线回归方程计算出凤尾草中黄酮类化合物的浓度，根据稀释倍数计算出凤尾草中黄酮类化合物的总含量［9，10］。 ２结果与分析 ２．１凤尾草黄酮类化合物的光谱特性 由吸收光谱图２可知，凤尾草黄酮类化合物在４００～７００ ｎｍ之间有一最大吸收峰，该最大吸收峰峰值出现在５２０ ｎｍ处。由于凤尾草黄酮类化合物对酸度很敏感，不同酸度会导致其最大吸收峰的移动［１1］，因此以下各试验要在相同的条件下，选择其对应的最大吸收峰进行测定。 ２．２提取剂对凤尾草黄酮类化合物提取率的影响 称取３份５．００ ｇ的凤尾草样品，分别以60%甲醇、60%乙醇、60%丙酮为提取剂定容至５０ ｍＬ，其中加入0.01 mol/L盐酸调节ｐＨ值为３．０。按上述凤尾草提取剂的制取方法提取凤尾草液。各取０．１ ｍＬ测其吸光度，计算提取率。不同提取剂对凤尾草黄酮类化合物提取率的影响见表１。表１表明，采用60%甲醇作为提取剂，其提取效果均与60%乙醇、60%丙酮作为提取剂差异显著，采用甲醇为提取剂提取率最高。因此，选择60%甲醇作为提取剂。 ２．３提取温度对凤尾草黄酮类化合物提取率的影响 称取６份５．００ ｇ样品研磨后，分别以60%甲醇为溶剂定容至５０ ｍＬ，其中加入0.01 mol/L盐酸调节ｐＨ值为３．０，于４０℃下提取60 min后，再分别在２０、３０、４０、５０、６０、７０℃水浴中超声波辅助提取3次，每次１０ ｍｉｎ，合并滤液，得凤尾草提取液。测定并计算提取率。不同提取温度对凤尾草黄酮类化合物提取率的影响见图３。由图３可见，黄酮类化合物的提取率随提取温度的升高总体呈下降趋势，但以提取温度为４０℃时最高。另在试验中观察到，当提取温度分别为５０℃和６０℃时，凤尾草提取液中出现白色絮状沉淀，且甲醇的沸点为６４～６５℃，在提取温度为６０℃时甲醇会大量挥发。分析结果表明，２０、３０、４０℃处理间差异不显著，而５０、６０℃处理与２０、３０、４０℃处理差异显著。故选择提取温度为４０℃。 ２．４提取时间对黄酮类化合物提取率的影响 称取４份５．００ ｇ样品，都以60%丙酮为提取剂定容至５０ ｍＬ，其中加入0.01 mol/L盐酸调节ｐＨ值为３．０，40℃分别提取２０、４０、６０、８０ ｍｉｎ。各取０．１ ｍＬ测其吸光度，计算提取率。 由表２可见，随提取时间的增加，黄酮类化合物的提取率呈先增大后减小的趋势，其中提取时间约为４０ ｍｉｎ时提取率最大。据报道，超声波可缩短提取时间，提高提取率，但其在一定频率和功率下也可使有机大分子降解［１２］。可以推断，在频率２４ ｋＨｚ时过长时间的超声波处理将导致黄酮类化合物的分解。因此，确定提取时间约为４０ ｍｉｎ。 ２．５样品分析 精密称取１０．００ ｇ凤尾草鲜草，按前述方法制备样品溶液，在波长５２０ ｎｍ处测其吸光度，分析结果凤尾草中黄酮类化合物的含量为１．８６３ ２ ｍｇ／ｇ。 ３结论 通过试验得知，超声波辅助提取凤尾草中的黄酮类化合物的最佳条件为：60%甲醇为提取剂、ｐＨ值为３．０的酸性条件、提取时间为４０ ｍｉｎ、提取温度为４０℃、超声次数为３次、每次1０ ｍｉｎ。凤尾草中含有丰富的黄酮类化合物，用超声波辅助提取时间短，原料利用率高，是一种值得采用的方法。 参考文献： ［１］ 刘清飞，秦明珠．凤尾草的形态组织学研究［Ｊ］．中药材，２００２（１０）：７０４－７０６． ［２］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会． 中华本草［Ｍ］． 上海：上海科学技术出版社，１９９９．１２２． ［３］ 余有贵，赵良忠，段林东，等． 凤尾草抗菌药物的提取与开发研究［Ｊ］． 邵阳高等专科学校学报，２００１（３）：１９９－２０３. ［４］ 胡浩斌，郑旭东． 青蕨根化学成分的研究［Ｊ］． 天然产物研究与开发，２００５，１７（２）：１６９－１７１． ［５］ 程存归，毛姣艳． 三种蕨www.LWlm.Com类植物挥发油的化学成分研究［Ｊ］． 林产化学与工业，２００５（２）：１０７－１１０． ［６］ 吴英华，马廷升， 蔡小华， 等． 凤尾草中总黄酮的提取工艺研究［Ｊ］． 怀化医专学报，２００７，６（２）：２０－２２． ［７］ 余俊，陈晓青， 蒋新宇， 等． 凤尾草中总黄酮的提取工艺研究［Ｊ］． 中成药，２００７，２９（１１）：１６８３－１６８５． ［８］ 张雁． 葛根保健饮料中黄酮类化合物稳定性的初步研究［Ｊ］． 华南师范大学学报（自然科学版），２００１（４）：５９－６２． ［９］ 相宇，李友宾，张健，等． 猪毛菜化学成分研究［Ｊ］． 中国中药杂志，２００７，３２（５）：４０９－４１３． ［１０］ ＨＵ Ｈ B，ＺＨＥＮＧ Ｘ D，ＣＡＯ Ｈ． Ｘａｎｔｈｏｎｅ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｐｔｅｒｉｓ ｍｕｌｔｉｆｉｄｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ），２００６，５３（２）：４５９－４６４． ［１１］ 向道丽． 酶法提取越桔果渣花色苷酶解条件的研究［Ｊ］． 中国林副特产，２００５，１２（６）：１－３． ［１２］ 岳辉吉，朱 杰． 天然色素的超声提取研究［Ｊ］． 现代生物医学进展，２００６，６（５）：１１－１３．