紫金龙总生物碱超声波辅助提取工艺
摘要：采用酸性染料比色法测定紫金龙（Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ）总生物碱的含量，通过正交设计方法，以总生物碱提取率为评价指标，优化超声波辅助提取工艺。结果表明，超声波辅助提取总生物碱的影响因素大小顺序为乙醇体积分数＞提取时间＞料液比，用料液比为1∶9（m/V，g∶mL），９０％（Ｖ／Ｖ，下同）的乙醇溶解，超声波辅助提取４０ ｍｉｎ为最佳提取工艺条件，此工艺条件下，总生物碱提取率为２．６９％。
关键词：紫金龙（Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ）；总生物碱；超声波辅助提取；正交设计 Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｗａｖｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ ＸＩＡＯ Ｆｅｎｇ－ｙａｎ１，ＧＡＯ Ｊｉｎｇ２，ＳＵＮ Ｌｉ－ｊｉａ１ （１． Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｊｉｌｉｎ １３２１０１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ； ２． Ｊｉｌｉｎ Ｊｉ’ａｎ Ｙｉｓｈｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｊｉｌｉｎ １３４２００，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｆｒｏｍＤａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａｃｉｄｉｃ ｄｙｅ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ． Ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｗａｓ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ＞ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ ｗａｓ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｒ ４０ ｍｉｎ ｕｓｉｎｇ ９－ｆｏｌｄ ｏｆ ８０％ ｅｔｈａｎｏｌ，ｕｎｄｅｒ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ２．６９％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ； ｔｏｔａｌ ａｌｋａｌｏｉｄｓ； ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ 紫金龙又称串枝莲、兹坚轮（白族语）等，系罂粟科植物紫金龙［Ｄａｃｔｙｌｉｃａｐｎｏｓ ｓｃａｎｄｅｎｓ （Ｄ．Ｄｏｎ） Ｈｕｔｃｈ．］的干燥根，其味苦、辛，性凉，具“镇痛、止血、消炎、降压，治疗胃痛、牙痛、神经性头痛、血崩、内出血、跌打损伤、高血压”等作用［１］。生物碱是紫金龙的主要药效物质［２－４］，有关其提取工艺的研究少见报道［５］。鉴于从紫金龙中用超声波辅助提取生物碱的研究未见文献报道，采用正交试验设计，对影响总生物碱提取率的多个因素进行了考察，以期优选出超声波辅助提取紫金龙总生物碱的最佳工艺条件。 １材料与方法 １．１材料 1.1.1中药材紫金龙，购于长春市药材公司，粉碎过４０目筛，备用。 １．1.3仪器电子分析天www.LWlm.Com平［梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司］；ＫＱ－３２００ ＤＢ型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率４０ｋＨｚ）；Ｒ２０６Ｄ旋转蒸发仪（西安禾普生物科技有限公司，２５０ ｍＬ）；ｐＨＳ－２Ｃ型数字式ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）；ＵＶ－７５２型紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。 １．2方法 １．2．１对照品溶液的配制［６］精密称取经Ｐ２Ｏ５真空干燥的异紫堇定对照品，置容量瓶内，加入０．０１％（Ｖ／Ｖ，下同）硫酸溶液，超声溶解并定容，配制成浓度为０．１６５ ｍｇ／ｍＬ的对照品储备液，然后分别精密吸取１、２、４、６、８和１０ ｍＬ，置１００ ｍＬ容量瓶内，加入０．０１％硫酸溶液定容，即得一系列浓度的异紫堇定对照品溶液。 １．2．２标准曲线的绘制［６］精密吸取上述一系列浓度的对照品溶液１．０ ｍＬ，置分液漏斗中，依次加入ｐＨ为３．０的醋酸盐缓冲液２．０ ｍＬ、０．０００ ７ ｇ／ｍＬ溴甲酚绿溶液１．０ ｍＬ、三氯甲烷１５．０ ｍＬ，振荡２ ｍｉｎ后，静置１５ ｍｉｎ分层，三氯甲烷层用干燥的滤纸滤过，收集的滤液即为对照品测定液，以空白对照液为空白，于４１５ ｎｍ波长处测定吸光度（Ａ）。以吸光度（Ａ）为纵坐标，异紫堇定的浓度（Ｃ）为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程为■＝５１．７４９x＋０．０４２（ｒ＝０．９９９ ９）；线性范围是０．００１ ６５～０．０１６ ５０ ｍｇ／ｍＬ。 １．2．３样品溶液的制备和总生物碱含量测定将紫金龙药材粗粉１０ ｇ，用乙醇溶液溶解后超声波辅助提取。提取液合并、浓缩，定容至５０ ｍＬ，精密量取１ ｍＬ，置圆底烧瓶内，蒸干，残渣再用体积分数为１％的硫酸溶液１０．０ ｍＬ溶解，转入１ ０００ ｍＬ容量瓶中，去离子水定容，摇匀，精密量取１．０ ｍＬ置分液漏斗中，按前述方法测定吸光度（Ａ），计算总生物碱的含量及提取率，提取率＝（样品中总生物碱的重量／药材重量）×１００％。 １．2．４提取工艺优化根据紫金龙中生物碱的种类和溶解性的特点，采用超声波辅助提取，分别考察了提取时间（Ａ）、料液比（Ｂ）、乙醇体积分数（Ｃ）三因素对总生物碱提取率的影响。依据单因素试验的结果确定各因素的合理水平，采用Ｌ9（３４）正交试验表进行正交试验以考察多因素对提取过程的交互影响，从而筛选出超声波辅助提取的最佳工艺。因素与水平设置见表１。 ２结果与分析 ２．１单因素试验结果分析 由图１看出，提取时间从１０ ｍｉｎ增加到４０ ｍｉｎ，紫金龙总生物碱提取率增幅较大，４０ ｍｉｎ后增幅平缓。由图２可知紫金龙总生物碱提取率随着料液比由１∶６（m/V，g∶mL）变化到１∶１３而增加，但当料液比小于１∶１０时，紫金龙总生物碱提取率增加缓慢。由图３可知，紫金龙总生物碱提取率随着乙醇体积分数的升高有所升高，当体积分数超过８０％后，提取率增长缓慢甚至降低。 ２．２正交试验结果分析表２中３种因素的Ｔ值表明各因素水平的影响程度是Ａ３＞Ａ１＞Ａ２，Ｂ３＞Ｂ１＞Ｂ２，Ｃ３＞Ｃ２＞Ｃ１，即最佳的提取条件为Ａ３Ｂ３Ｃ３。表２极差分析结果的Ｒ值大小与表３方差分析结果的Ｆ值皆表明３种因素对紫金龙总生物碱提取率的影响是Ｃ＞Ａ＞Ｂ，即乙醇体积分数＞提取时间＞料液比；且乙醇体积分数（Ｃ）各水平间差异极显著（Ｐ＜０．０１），提取时间（Ａ）各水平间为差异显著（Ｐ＜０．０５），料液比（Ｂ）各水平间差异不显著（Ｐ＞０．０５），说明提取时间（Ａ）、乙醇体积分数（Ｃ）为影响紫金龙总生物碱提取率的主要因素，尤其是乙醇体积分数（Ｃ）。综上所述，同时考虑经济因素，可选择Ａ３Ｂ１Ｃ３作为合适的提取条件。
２．３验证性试验结果 Ａ３Ｂ１Ｃ３和Ａ３Ｂ３Ｃ３两种工艺均重复提取２次，然后采用ｔ检验对试验结果进行比校。结果表明２种工艺对总生物碱的平均提取率分别为２．６９％和２．７１％，二者之间差异不显著。综合考虑确定超声波辅助提取紫金龙总生物碱的最佳提取工艺为Ａ３Ｂ１Ｃ３，即用料液比1∶9，体积分数９０％的乙醇溶解，超声波辅助提取４０ ｍｉｎ。 ３讨论 以总生物碱提取率为评价指标的正交试验结果表明超声波辅助提取最佳方案为Ａ３Ｂ３Ｃ３，用料液比1∶11，体积分数９０％的乙醇溶解，超声波辅助提取４０ ｍｉｎ。在３个因素中，影响紫金龙总生物碱提取率最重要的因素是乙醇体积分数和提取时间，即体积分数９０％乙醇溶解，超声４０ ｍｉｎ。料液比对紫金龙总生物碱提取率有一定影响，但影响不显著，为节省溶剂用量，可选择料液比1∶9。验证试验结果表明，溶剂量的改动对总生物碱提取率的影响不显著，故超声波辅助提取紫金龙总生物碱的最佳提取工艺为用料液比1∶9，体积分数９０％的乙醇溶解，超声提取４０ ｍｉｎ。 参考文献： ［１］ 中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志（第３２卷）［Ｍ］． 北京：科学出版社，１９９９．８９－９１． ［２］ 吴大刚． 紫金龙的生www.LWlm.Com物碱成分［Ｊ］． 云南植物研究，１９７５（２）：１５３－１５５． ［３］ 钱金袱，周粤． 白族草药紫金龙成分的研究［Ｊ］． 西北药学杂志，２０００，１５（２）：５７－５８． ［４］ 严田青，艾铁民．紫金龙化学成分的研究［Ｊ］．中草药，２００４，３５（８）：８６１－８６２． ［５］ 陈庆党，刘汉源．正交试验法优选紫金龙提取的最佳工艺条件［Ｊ］． 中草药，１９９６，２７（增刊）：１０２－１０３． ［６］ 张文鑫． 紫金龙药材及其治疗失眠复方片剂药学研究［Ｄ］． 郑州：河南中医学院，２００８．