摘要：采用酸性染料比色法测定苦马豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]中总生物碱含量。以苦参碱为标准品，溴麝香草酚蓝为染色液，在pH 7.6缓冲溶液中与生物碱反应，反应产物用氯仿萃取，萃取液于414 nm处测定其吸光度。应用建立的酸性染料比色法对宁夏不同地区采集的苦马豆样品中总生物碱含量进行分析。结果表明，苦参碱在0.001 7～0.013 3 μg/μL内与吸光度线性关系良好，回归方程为y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦参碱的平均回收率为103.17（RSD为1.70%），测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆中总生物碱质量分数分别为0.026%、0.024%、0.017%。该方法灵敏、可靠、操作简便，可用于苦马豆中总生物碱含量的测定。
关键词：苦马豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]；酸性染料比色法；总生物碱；苦参碱
中图分类号：R927.2；O657.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）07-1710-03
苦马豆[Swainsonia salsula Taubert（Sphaerophysa salsula （Pall.）DC.）]是豆科苦马豆属草本植物，别名羊卵蛋、羊尿泡、尿泡草、红花苦豆子等，广泛分布于内蒙古、宁夏、甘肃、青海、新疆等地[1]。苦马豆全草、果可入药，民间用于治疗肾炎、慢性肝炎、肝硬化腹水等疾病。苦马豆含有黄酮、生物碱、异环烷、木脂素、酚酸、萜及甾醇类化合物[2]。目前对苦马豆的总黄酮含量进行了深入分析，但总生物碱含量的研究尚未见报道。研究表明，苦马豆中含有苦参碱[3]、苦马豆碱（Spherophysine）[4]、苦马豆素（Swainonine）[5]、麦角碱（Ergotine）[1]等多种生物碱，该类生物碱具有调节血压、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、调节免疫、治疗产后出血和帕金森病等作用[2，3，6]。因此，测定苦马豆总生物碱含量可对苦马豆的药材质量评价和临床应用提供重要的科学依据。苦马豆也是一种有毒植物，家畜过量采食会导致中毒死亡[7]，给草原畜牧业造成严重的经济损失，有报道生物碱可能是导致动物中毒的重要原因[4]，测定苦马豆中生物碱的含量，也可为动物苦马豆中毒的防控提供科学依据。
目前，用于植物样品生物碱测定的方法有薄层色谱扫描法、高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）、重量法、酸碱滴定法、酸性染料比色法等。薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法灵敏度高，测量准确，适用于对植物样品中各生物碱组分的定量分析，但所需设备昂贵，操作复杂，技术要求较高，一般无法检测在紫外可见光区吸收较弱或无吸收的化合物。而重量法、酸碱滴定法的灵敏度较低，误差较大，一般用于总生物碱含量的粗略评估。酸性染料比色法是根据生物碱在一定pH介质中与酸性染料发生反应，形成可被紫外分光光度计检测的具有生色基团络合物的原理建立的方法，该方法具有灵敏度高、重现性好、操作简便、样品处理简单等特点，近年来已广泛用于苦参、苦豆子等中药材中总生物碱含量的测定[8-12]。本研究拟以苦参碱为对照品，用酸性染料比色法，对宁夏不同地区采集的苦马豆总生物碱含量进行测定，为苦马豆药材质量评价、临床应用和动物苦马豆中毒的防控提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物样品 苦马豆全草，采于宁夏平罗县、盐池县和银川市，采集后风干、粉碎备用。
1.1.2 主要试剂和仪器 苦参碱标准品购自中国食品药品检定研究院，生产批号为110805-200508；溴麝香草酚蓝、甲醇、乙醇、氯仿、氨水、氯化铵等均为分析纯。DU800型紫外分光光度计（美国贝克曼公司）。
1.2 方法
1.2.1 苦参碱标准品溶液的制备 标准品溶液的配制：精密称取10.0 mg苦参碱标准品，用体积分数为50%乙醇定容于10 mL的容量瓶中，配制成1 mg/mL标准品溶液。
1.2.2 供试样品溶液的制备 称取苦马豆草粉1.00 g，用滤纸包好后放入索式提取器，加入100 mL甲醇，80 ℃提取24 h，取出提取液，浓缩至干，残渣用5 mL体积分数为2%乙酸溶液溶解。将乙酸溶液加入装有5 g 732型阳离子交换树脂（NH4+型）的分离柱中，静置过夜后先加入去离子水洗脱树脂，待洗脱液呈中性时，再用1 mol/L的氨水溶液洗脱，收集水洗脱液，浓缩至干，用1 mL乙醇溶解，离心后取上清液用体积分数为50%乙醇稀释，备用。
1.2.3 最大吸收波长的确定 分别取标准品溶液20 μL、供试样品溶液100 μL，分别加入具塞试管中，挥干溶剂后，每管中分别加入pH 7.6的质量体积分数为0.012 5%的溴麝香草酚蓝溶液6 mL，氯仿6 mL，然后倒入分液漏斗中剧烈振荡2 min，静置2 h。取氯仿层溶液，置于紫外分光光度计中，在300～900 nm内扫描，测定其最大吸收波长。
1.2.4 标准曲线的绘制 取标准品溶液0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，分别加入9支具塞试管中并挥干溶剂，按“1.2.3”项下方法处理后，于紫外分光光度计测定其414 nm处的吸光度，以吸光度为纵坐标（y）、苦参碱浓度为横坐标（x）绘制标准曲线，得出线性回归方程并确定线性范围。
1.2.5 稳定性试验 取标准品溶液60 μL，加入具塞试管中并挥干溶剂，按“1.2.3”项下方法处理后，分别在0、1、2、3、4、6、8、10、12 h时测定其414 nm处的吸光度，根据线性回归方程计算样品含量，并计算相对标准偏差（RSD）。 1.2.6 精密度试验 取5份标准品溶液，每份50 μL，加入具塞试管中并挥干溶剂，按 “1.2.3”项下方法进行处理，然后置于紫外分光光度计中测其414 nm处的吸光度，根据线性回归方程计算样品含量，并计算RSD。
1.2.7 加标回收试验 称取已知生物碱含量的苦马豆样品（266.34 μg/g）1 g，按“1.2.2”项下方法分别制备样品溶液，将样品溶液平均分为5份，加入苦参碱标准品溶液60 μL。将每份样品溶液加入具塞试管中并挥干溶剂，按“1.2.3”项下方法处理后测其414 nm处的吸光度，根据线性回归方程计算回收率，并计算RSD。
1.2.8 样品含量的测定 精密称取宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆草粉各3份，每份1 g，按“1.2.2”项下方法制备供试样品溶液，从每份样品溶液中各取100 μL加入具塞试管中并挥干溶剂。按“1.2.3”项下方法处理后在414 nm处测定吸光度，根据线性回归方程计算苦马豆样品中总生物碱的含量。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长
经测定，供试样品溶液最大吸收波长分别在355和414 nm处有较强吸收，但414 nm处吸收最强（图1）。苦参碱标准品溶液在414 nm处有最强吸收，故本试验采用414 nm作为测定生物碱的吸收波长。
2.2 标准曲线的绘制
以苦参碱标准品溶液414 nm的吸光度为纵坐标（y），苦参碱浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到标准曲线方程为y=50.549 0x-0.047 7（R2=0.999），苦参碱检测浓度在0.001 7～0.013 3 μg/μL内与吸光度线性关系良好。
2.3 稳定性、精密度及加标回收试验
经测定，本方法稳定性试验和精密度试验的RSD分别为4.26%（表1）和5.29%（表2），说明该方法精密度较好，供试样品溶液在12 h内较稳定。加标回收试验结果如表3所示，平均回收率为104.31%，RSD为1.70%。表明系统误差符合分析条件，测试结果准确度高，可靠性强。
2.4 样品中生物碱含量的测定
测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆样品中生物碱质量分数分别为0.026%、0.024%和0.017%（表4）。
3 小结与讨论
试验结果表明，宁夏不同地区采集的苦马豆样品中总生物碱含量差异较大，其中宁夏平罗县和盐池县采集的苦马豆样品中总生物碱含量较高，其生物碱质量分数分别为0.026%、0.024%，而银川市采集的样品中生物碱含量较低（0.017%）。苦马豆广泛分布于中国西北地区，不同的生长环境、气候可能对其生物碱含量产生重要影响。因此，需进一步对我国不同区域苦马豆中生物碱含量进行分析，从而为苦马豆的开发利用提供科学依据。
杨毅恒[13]用苦参碱为标准品测定苦参药材中生物碱的含量，在pH 7.6条件下，与溴麝香草酚蓝络合成可被氯仿萃取的有色离子对，在417 nm处有最大吸收，建立的方法专属性强，结果准确可靠。在本试验中，当缓冲溶液pH为7.6时，苦马豆与溴麝香草酚蓝络合生成可被氯仿萃取的具有生色基团的化合物，在355和414 nm处均出现较大吸收峰，其中414 nm处吸收最强。而对照标准品苦参碱与酸性染料反应后，仅在414 nm处有最大吸收峰，故本试验选择414 nm作为苦马豆总生物碱的检测波长。经酸性染料处理的待检溶液在12 h内较稳定，精密度较好，系统误差较小，测试结果准确度较高，可靠性较强。表明该方法可用于苦马豆总生物碱的定量分析，并测得宁夏平罗县、盐池县、银川市采集的苦马豆中总生物碱质量分数分别为0.026%、0.024%和0.017%。
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