黄芩苷对Ac-LDL+LPS诱导的与动脉粥样硬化相关巨噬细胞凋亡的影响动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)相关心血管疾病的发生与AS 斑块的不稳定性密切相关。巨噬细胞是不稳定斑块的主要细胞成分,其凋亡与As斑块的破裂相关。研究发现巨噬细胞凋亡的结果在AS 的早期和晚期是不同的。早期病变中,巨噬细胞的凋亡有利于抑制病变细胞泡沫化,显著降低早期病变面积。晚期巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化斑块的破裂密切相关。

p38 蛋白激酶通路是已确定的 MAPKs 家族成员之一,参与细胞的生长、发育以及细胞间功能同步等多种生理过程,并与炎症、应激反应的调控密切相关。p38 MAPK通路也参与介导凋亡的信号传导,促进巨噬细胞的凋亡。

黄芩苷(baicalin)是由黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,是黄芩的主要有效成分之一。近年来,大量研究发现,黄芩苷具有抗动脉粥样硬化作用。然而对黄芩苷抗AS 的作用机制并没有明确的阐明。通过整体及离体实验研究发现,黄芩苷对肺炎衣原体感染所致AS 病理过程具有良好的阻抑作用。本实验以脂多糖和乙酰低密度脂蛋白双重打击诱导离体培养的巨噬细胞凋亡,观察黄芩苷对凋亡及凋亡相关P38 MAPK信号通路的影响,从巨噬细胞凋亡信号通路方面论证黄芩苷干预动脉粥样硬化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RAW264.7细胞购自中山医学院细胞中心;0.25% 胰酶、DMEM 培养液、脂多糖、培养瓶、PBS、胎牛血清、青霉素、链霉素购自广州斯佳生物科技有限公司;乙酰低密度脂蛋白、脂多糖、黄芩苷、AnnexinV FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、Westernblot 检测试剂盒购自广州晨展生物公司。

1.2 巨噬细胞的收集及试验分组

RAW264.7细胞株常规培养于含100 g/mL青链霉素、10% 胎牛血清的RPMI1640 完全培养液,置37 ℃、5% CO2、饱和湿度中培养,所有实验均在细胞处于对数生长期进行。黄芩苷剂量参照邝氏实验,乙酰低密度脂蛋白用量参照Venkateswaran A实验,脂多糖用量参照万氏实验,试验分为7组,即为(1)正常组:巨噬细胞采用原培养基孵育;(2)乙酰低密度脂蛋白对照组:原培养基中吸出125 L 上清液,加入100 g/mL Ac-LDL 125 (3)脂多糖对照组:原培养基中吸出50 L 上清液,加入1 g/mL LPS 50 (4)模型组:原培养基中吸出175L上清液,加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50(5)低剂量观察组:原培养基中吸出275L 上清液,加入100 g/mLAc-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +120 g/mL黄芩苷含药血清100(6)中剂量观察组:原培养基中吸出275L 上清液,加入100 g/mL Ac-LDL 125L +1 g/mL LPS 50L +240 g/mL 黄芩苷含药血清100(7)高剂量观察组:原培养基中吸出275L上清液,加入100 g/mL Ac-LDL125g/mL LPS 50L +480 g/mL黄芩苷含药血清100L。

1.3 AnnexinVFITC/PI细胞凋亡检测

用完全培养液调整细胞数为1.5105 个/mL,接种于24 孔板,待细胞贴壁后,分组方法同前,刺激物加入24 h 后,用不含EDTA 的胰酶消化细胞,PBS洗2 次,按试剂盒说明书要求染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 Western-blot检测P38的表达

另取细胞接种于12 孔板,待细胞贴壁后,分组方法同1.2项下,刺激物加入 4 h 后,加入细胞裂解液,采用Western - blot 法检测P38-MAPK 含量。具体步骤如下:将细胞收集裂解后进行丙稀酰胺凝胶电泳,电泳后,将胶上的 DNA 转移到 PVDF 膜上,PVDF膜用封闭液封闭之后,TBST 液洗膜 3 次,并分别加入鼠P38 4 ℃过夜。并用鼠 GAPDH 单抗(一抗)作为内参照。TBST 液再洗膜 3 次后,加入HRP 标记的羊抗鼠二抗室温振荡 2 h,洗膜后,加入LumiGLO 底物,对X 胶片(Kodak,日本)适度曝光后,显影,定影。

1.5 实时荧光定量PCR技术检测JNK蛋白表达

使用qRT-PCR法,操作步骤按试剂盒说明书完成。

1.6 统计学处理

数据采用SPSS 13.0 统计软件,采用方差分析__(ANOVA)模块,组间比较采用t 检验。

2 结果

2.1 流式细胞仪检测细胞凋亡

正常组、对照组与模型组的凋亡率差异有统计学意义(P 0.01),模型组细胞凋亡率明显高于正常组和对照组,可知实验造模成功。黄芩苷低剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异无统计学意义(P 0.01)。黄芩苷中、高剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P 0.01),黄芩苷中、高剂量观察组细胞凋亡率明显高于模型组,而高剂量观察组细胞凋亡率又高于中剂量观察组。结果见表1。以Annexin-FITC和PI(propidium,碘化丙锭)双标法经流式细胞仪检测RAW264.7 巨噬细胞凋亡率。

2.2 Western-blot检测磷酸化P38的表达

常规培养基孵育的巨噬细胞(正常组)中有少量磷酸化P38 表达,定义为1。在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干预下,磷酸化P38 表达皆升高。乙酰低密度脂蛋白对照组与脂多糖对照组磷酸化P38 相对表达量为:2.0、1.2,模型组中磷酸化P38表达明显,为2.2。这表明在Ac-LDL、LPS、Ac-LDL+LPS的干预下磷酸化P38 表达水平皆增加,Ac-LDL+LPS模型组最明显,证明建模成功。经过黄芩苷的处理,低、中、高剂量观察组磷酸化P38 表达量分别为1.8、1.6、3.8。可见,Ac-LDL+LPS联合打击较Ac-LDL或LPS单独干预的巨噬细胞中P38 高。黄芩苷低、中剂量观察组对磷酸化p38表达无明显的促进或抑制作用,高剂量观察组磷酸化P38 表达量明显增高。

3 讨论

本实验采用乙酰低密度脂蛋白及脂多糖双重打击诱导巨噬细胞凋亡。实验发现,在LPS复合高脂条件下培养后巨噬细胞凋亡显著增加,正常组、对照组与模型组的细胞凋亡率差异有统计学意义(P 0.01),模型组细胞凋亡率明显高于正常组和对照组,可知实验造模成功。在巨噬细胞凋亡显著增加的同时,模型组也出现了较高水平磷酸化P38 的表达,这说明脂多糖和乙酰低密度脂蛋白双重打击是诱导巨噬细胞凋亡的重要原因,P38-MAPK信号通路参与这一过程。黄芩苷高剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义(P 0.01),同时黄芩苷高剂量组磷酸化P38 表达明显增强,较模型组有统计学意义。可见,高剂量的黄芩苷可能通过激活P38 通路促进早期AS斑块中巨噬细胞凋亡。黄芩苷中剂量观察组与模型组细胞凋亡率相比差异有统计学意义,黄芩苷低、中剂量组磷酸化P38 表达较模型组无统计学意义。综上所述,随着黄芩苷浓度的上升,细胞凋亡率升高。高剂量的黄芩苷可能通过激活P38-MAPK信号通路促进巨噬细胞凋亡,而具体激活P38MAPK信号通路的最小剂量有待进一步研究。中量黄芩苷组磷酸化P38 表达较模型组无计学意义,但其仍促进巨噬细胞的凋亡,考虑中剂量黄芩苷可能通过JNK、SRA 等其他通路促进细胞凋亡,需进一步研究以阐明。

动脉粥样硬化斑块越不稳定,越易破裂,斑块破裂后易导致血栓形成。而巨噬细胞是不稳定斑块的主要细胞成分。巨噬细胞凋亡在AS 发生发展中起着非常重要的作用,它贯穿了AS整个过程。Tracie 等[17-18] 用多种基因敲除动物模型深入研究了FC 引起巨噬细胞凋亡的机制,发现主要需要3个通路的同时作用,这3 个通路分别为氨基端激酶(JNK)通路、P38-UPR-CHOP通路和A 型清道夫受体(SRA)通路。P38 表达与巨噬细胞凋亡有密切联系[19-20]。近年国内外学者以LPS 和乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)加酰基辅酶A- 胆固醇酰基转移酶抑制剂(58035)条件成功诱导巨噬细胞凋亡。近年来,大量研究也发现,黄芩苷具有抗动脉粥样硬化作用。然而对黄芩苷抗AS 的作用机制并没有明确的阐明。马珺等研究显示黄芩苷可以通过调节血脂及抗氧化作用对AS 起到干预作用;于昕等研究提示黄芩苷可能通过降血脂、改善凝血纤溶系统平衡、下调凝血酶激活纤溶抑制物(TAFI)水平等途径干预AS 的形成;吴伟等研究证明黄芩苷可以明显降低血清TNF、IL-6 及IL-10 水平,通过抑制炎症反应从而发挥其对AS 的早期干预作用;李岩等研究提示黄芩苷可能通过抗炎作用发挥其对AS的干预作用。

在动脉粥样硬化早期的病变中(即坏死核心发展之前),巨噬细胞凋亡与病灶大小呈反比关系,巨噬细胞的凋亡有利于抑制病变细胞泡沫化,显著降低早期病变面积。早期病变巨噬细胞死亡的有益方面已经用缺陷鼠来阐明,AIM-/- 和LDLR-/- 双敲除鼠表明增加了巨噬细胞的死亡,可显著降低早期病变面积。也有研究发现,在病变早期[23-24],巨噬细胞吞噬功能很强,主要针对脂蛋白,也可有效吞噬清除凋亡细胞,限制活体内动脉粥样硬化病变的大小,而在此过程中巨噬细胞本身也遭受凋亡细胞所释放的细胞因子的影响而发生凋亡,可见在动脉粥样硬化病变早期巨噬细胞凋亡是减少病变成分,抑制动脉粥样硬化进展的表现。

根据本实验研究数据,综合当前研究现状,高剂量的黄芩苷可能通过激活P38 MARK 信号通路促进早期AS 斑块中巨噬细胞凋亡,抑制病变细胞泡沫化,减少病变成分,降低病变面积从而拮抗早期动脉粥样硬化斑块的病理进程。低剂量黄芩苷的作用不明显,提示较高浓度的黄芩苷才能激活相关通路,发挥拮抗早期动脉粥样硬化的作用。随着如血管内超声成像等各种检测技术的日益完善,我们可以更多的从黄芩苷促进早期AS 斑块巨噬细胞凋亡方面入手,深入研究黄芩苷的抗动脉粥样硬化作用,利用黄芩苷对动脉粥样硬化中巨噬细胞凋亡进行更有利的调控,为早期有效干预动脉粥样硬化的进展提供新的治疗靶点。