摘要针对麻痹性贝毒的检测技术,着重从生物学测试方法、化学测试分析方法2个方面概括地介绍了贝毒检测技术研究的进展。总结了几种相关检测技术各自的优点和不足及几种方法有机结合和优势互补,提出了技术的革新和新方法的使用将是贝类毒素检测手段的发展方向。
关键词麻痹性贝毒;分析方法;生物学测试法;化学测试法
中国论文 联盟 Www.LMlm.Com
AdvancEintheResearchMethodtoDetermineDiarrheticShellfishPoisons
SHI Chang-leiZHOU Zhi-gangLIU TongDING Jia-linYU Yong-gang
(The Fishery Technology Spread Station of Lvshun in Dalian City of Liaoning Province,Dalian Liaoning 1160
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1)
AbstractIn this paper,focusing on the detection of paralytic shellfish poisoning techniques,the biological testing methods,and chemical test analysis methods were described in general on shellfish poisoning detection technology progress. The advantages and disadvantages of several related detection techniques,and several ways to combine and complement each other were summarized. New technology and new methodology will be the direction for shellfish toxins.
Key wordsparalytic shellfish poisoning toxins(PSP);analytical method;biological method;chemicalmethod
随着社会的发展,人们的生活质量渐渐提高,各种海产贝类食品越来越多地进入了寻常百姓家的餐桌,并且越来越受到欢迎。然而人们在享受美味的同时,却不知道有些贝类是有毒的,使近年来贝类中毒事件频繁发生[1-3]。海洋中的贝类有扇贝、蛤蜊、贻贝等,它们均以生活在海水中的单细胞藻类为食物。但有些单细胞藻类是有毒的[4],当贝类摄食了大量有毒藻类时,毒素就会在贝类体内累积,使贝类具有毒素,这种毒素称为贝毒。贝类中的毒素以麻痹性贝毒与腹泻性贝毒的危害最严重,加热和冷却均不能将其破坏[5]。而麻痹性贝毒是剧毒性化合物,对生物神经系统或心血管系统有高度特异毒性。世界各国对其进行了大量的研究和分析[5-6],为此笔者对国内外麻痹性贝毒中常见的分析方法进行综述,为研究麻痹性贝毒提供理论帮助。
1生物学测试方法
1.1小鼠生物测试法 1.2其他生物体内测试法
家蝇生物测试法分析PSP:将PSP的酸性提取液注入家蝇的体内,观察家蝇的活动特征,并记录死亡时间。分析方法与小鼠生物测试很相近。用该方法检测贝样中PSP的最低限为20 pgSTXeq/100 g贝组织[11]。但由于该方法需要借助显微镜注射样品,操作困难,没有被推广使用。 1.3细胞毒性测试法 1.4免疫测试分析法 1.5放射受体分析法
对于PSP毒素的分析,人们建立了放射受体分析法[15],其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的Na+通道受体固定在微滴板表面,通过待测样品和氛标记的标准STX(3H-STX)与受体的竞争性结合,来测定样品中PSP毒素的毒性。该方法对PSP毒素的敏感性极高,检出限达4 ngSTXeq/min。
2化学测试方法
2.1电泳技术测试法
2.1.1平板电泳法。对于PSP毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种分离检测方法[16]。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,能够快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进行检测,提高了这种方法的灵敏度[17]。 Wright等[18]利用CE系统和荧光检测器建立了分析STX毒素的方法,检测限达1 pg/kg。但该系统需要对STX毒素衍生后再进行检测,设备也非常昂贵。Thibault利用CE系统和紫外检测器建立了分析neoSTX和STX毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。
2.2色谱技术测试法 2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquid chromatography,LC)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为PSP分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了LC分析PSP毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,Sullivan[20]使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析PSP的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基PSP毒素。但该方法对STX和dcSTX毒素的分辨率很低[21],未得到推广。Thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以提高脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法[22],但不能够分辨PSP毒素中的某些手性异构体。Oshima [23]使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法能够分析绝大多数的PSP毒素。由于PSP毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差别,因此在分析时需要有标准毒素才可以进行定性和定量分析。对C毒素的分析,一般采用水解的方法进行间接分析。
2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个合适的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱分离后的检测器,可充分发挥色谱的分离优势和质谱的定性优势,达到对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把PSP成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(ESI),另一种是大气压化学电离(AP-Cl),这2种技术目前都已经应用于PSP分析。
Eike等[24]采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和MS检测器分析PSP毒素,检测限为0.8 μg/g。该方法的优点是使用NH4COOCH3水溶液作为流动相进行阴阳离子交换联合层析,这种流动相能够进行在线LC-MS分析,并且能够在一次进样层析中分离STX、GTXs、neoSTX、dcSTX等麻痹性贝毒,省去了AOAC传统色谱分析方法中繁琐的毒素分离前处理过程。Eike还对此方法做了改进,使用CE(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用LC-MS联用技术,分析麻痹性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的LC高一个数量级。
3结语
近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类健康,有关PSP的中毒事件屡见不鲜,而我国开展PSP方面的研究还不够深入,麻痹性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比较晚,仅涉及PSP毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题[25]。PSP毒素作为海洋生物活性物质药物的研究,也少有文章报道。
海产贝类作为我国主要出口创汇产品之一,还未形成配套的卫生质量标准及监测监控体制。由于无法提供养殖海域贝毒监测资料,自1997年欧盟对我国的养殖贝类产品禁止进口以来,到目前为止欧洲市场一直未对我国开放。为了维护和发展我国贝类养殖业,确保海产品的食用安全和促进海产品的出口贸易等,我国应在以下几个方面加强研究:一是加强保护近岸海域养殖生态环境;二是研制快速检测PSP使用的试剂盒;三是PSP毒素标准品的制备;四是寻找PSP中毒的治疗解药;五是制定我国PSP的监测方案和水产品的HAPPC体系。
4参考文献
[1] 邱德金,林永水,周近明,等.利玛原甲藻腹泻性毒素的生物学测定[J].热带海洋,1996
(4):46-49. [3] 梁松,钱宏林.加强贝毒管理工作的探讨[J].海洋通报,1993,12
(2):83-88. [5] 野口玉雄. 麻ひ性贝毒[J].海洋科学,1984,16
(10):587-594. [7] HOLLINGWORTH T,WEKELL M M.Fish and other marine Products 959.08.Paralytic shellfish Poisoning.Biological Method,Final Action[M]∥HELLRICH L K.Oficial methods of analysis of the assoeiation of ofici-alan alyticalch emists(15th Edition),1990:881-882.
[8] 许敏,赵以军,程凯.水华和赤潮的毒素及其检测与分析[J].湖泊科学,2001,13
(4):376 对于PSP毒素的分析,人们建立了放射受体分析法[15],其主要原理是:取大鼠大脑细胞膜上的Na+通道受体固定在微滴板表面,通过待测样品和氛标记的标准STX(3H-STX)与受体的竞争性结合,来测定样品中PSP毒素的毒性。该方法对PSP毒素的敏感性极高,检出限达4 ngSTXeq/min。
2化学测试方法
2.1电泳技术测试法
2.1.1平板电泳法。对于PSP毒素的检测,人们使用凝胶和纸电泳技术建立了多种分离检测方法[16]。该方法通常使用过氧化氢显色,用紫外灯检测,能够快速检测一些样品,但其对样品是无法定量的。后来有人使用扫描荧光检测器进行检测,提高了这种方法的灵敏度[17]。 Wright等[18]利用CE系统和荧光检测器建立了分析STX毒素的方法,检测限达1 pg/kg。但该系统需要对STX毒素衍生后再进行检测,设备也非常昂贵。Thibault利用CE系统和紫外检测器建立了分析neoSTX和STX毒素的方法,但其检出限太高,目前只能用于对天然产物的初扫描。
2.2色谱技术测试法 2.2.2液相色谱法。液相色谱法(liquid chromatography,LC)在海洋生物毒素的化学检测方法中占主导地位。该方法在20世纪90年代成为PSP分析技术研究领域的热点。在过去的10余年中人们建立了LC分析PSP毒素的常规方法,并逐步完善。1988年,Sullivan[20]使用离子交换色谱和柱后衍生建立了分析PSP的方法,可分析12种氨甲酞基和磺化氨甲酞基PSP毒素。但该方法对STX和dcSTX毒素的分辨率很低[21],未得到推广。Thibault等使用离子对试剂和切换洗脱液的方法可以提高脱氨甲酞基毒素的分辨率。由于柱后衍生系统的使用带来了峰扩展的问题,为此有人提出使用柱前衍生的方法[22],但不能够分辨PSP毒素中的某些手性异构体。Oshima [23]使用三次等梯度洗脱和柱后衍生的方法能够分析绝大多数的PSP毒素。由于PSP毒素缺少发色基团,并且不同的毒素在不同衍生条件下获得产物的比率不同,不同产物的荧光信号强度也有较大的差别,因此在分析时需要有标准毒素才可以进行定性和定量分析。对C毒素的分析,一般采用水解的方法进行间接分析。
2.2.3色谱联用技术。色谱联用是指通过一个合适的方式,将用于定性分析的质谱联接成为色谱分离后的检测器,可充分发挥色谱的分离优势和质谱的定性优势,达到对样品很好地定性和定量分析的目的。液质联用依赖于高效液相色谱把PSP成分通过界面装置带到质谱中。有2种界面技术可用,一种是电喷雾电离(ESI),另一种是大气压化学电离(AP-Cl),这2种技术目前都已经应用于PSP分析。
Eike等[24]采用高效离子交换色谱,样品柱后电化学氧化,平行使用荧光和MS检测器分析PSP毒素,检测限为0.8 μg/g。该方法的优点是使用NH4COOCH3水溶液作为流动相进行阴阳离子交换联合层析,这种流动相能够进行在线LC-MS分析,并且能够在一次进样层析中分离STX、GTXs、neoSTX、dcSTX等麻痹性贝毒,省去了AOAC传统色谱分析方法中繁琐的毒素分离前处理过程。Eike还对此方法做了改进,使用CE(毛细管电泳)代替荧光检测器,采用LC-MS联用技术,分析麻痹性贝毒,结果比只使用带荧光检测器的LC高一个数量级。
3结语
近年来,由于工业废水、生活污水等大量排入,造成海水富营养化,导致赤潮频发。赤潮中藻类大量繁殖,对贝类养殖业造成严重的经济损失,更是危害人类健康,有关PSP的中毒事件屡见不鲜,而我国开展PSP方面的研究还不够深入,麻痹性贝毒在双壳贝类体内的动力学研究起步比较晚,仅涉及PSP毒素在贝体内的累积、排除和转化规律等有关问题[25]。PSP毒素作为海洋生物活性物质药物的研究,也少有文章报道。
海产贝类作为我国主要出口创汇产品之一,还未形成配套的卫生质量标准及监测监控体制。由于无法提供养殖海域贝毒监测资料,自1997年欧盟对我国的养殖贝类产品禁止进口以来,到目前为止欧洲市场一直未对我国开放。为了维护和发展我国贝类养殖业,确保海产品的食用安全和促进海产品的出口贸易等,我国应在以下几个方面加强研究:一是加强保护近岸海域养殖生态环境;二是研制快速检测PSP使用的试剂盒;三是PSP毒素标准品的制备;四是寻找PSP中毒的治疗解药;五是制定我国PSP的监测方案和水产品的HAPPC体系。
4参考文献
[1] 邱德金,林永水,周近明,等.利玛原甲藻腹泻性毒素的生物学测定[J].热带海洋,1996
(4):46-49. [3] 梁松,钱宏林.加强贝毒管理工作的探讨[J].海洋通报,1993,12
(2):83-88. [5] 野口玉雄. 麻ひ性贝毒[J].海洋科学,1984,16
(10):587-594. [7] HOLLINGWORTH T,WEKELL M M.Fish and other marine Products 959.08.Paralytic shellfish Poisoning.Biological Method,Final Action[M]∥HELLRICH L K.Oficial methods of analysis of the assoeiation of ofici-alan alyticalch emists(15th Edition),1990:881-882.
[8] 许敏,赵以军,程凯.水华和赤潮的毒素及其检测与分析[J].湖泊科学,2001,13
(4):376-384.
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