骨折愈合是一个涉及多种细胞、细胞因子及各种基因表达的复杂的生物学过程。目前研究认为骨折部位血肿提供了成骨潜力细胞、炎性细胞、免疫细胞等成分，有骨诱导因子和细胞外基质等提供环境因素及支架功能，以往被认为对骨折断端仅起到物理支撑作用，无其他生物学作用。现已有许多学者根据血肿的生物学作用，将骨折部位血肿应用在临床手术上且获得较满意的效果，而其在骨折愈合中的相关作用机制也逐渐被深入研究。国内学者对骨折部位血肿的研究主要集中在术中应用上，而国外学者则更专注其促进骨折愈合的主要成分及作用机制。血肿是骨折愈合的反应池，提供最原始的骨传导作用，它涉及骨、血管组织再生、免疫系统等多个方面，能反映骨折修复的进程，影响着骨折愈合的程度。本文阐述国内外学者对骨折部位血肿的应用、研究进展及血肿促进骨折愈合的相关机制并进行系统性的分析。
【关键词】 骨折； 血肿； 骨折愈合
中图分类号 R336 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）13-0157-03
骨折部位血肿是由骨折处血管破裂，红细胞溢出并弥漫在骨折端和周围组织形成的。它出现在骨折愈合过程的血肿炎症机化期。随着血肿机化逐渐步入骨痂形成、改造期，最终使骨的完整性恢复。本文就骨折部位血肿的应用及其促进骨折愈合相关机制进行系统性的分析和综述。
1 骨折部位血肿的生物学作用的研究背景和应用进展
上世纪30年代已有学者从组织学上研究骨折部位血肿，但直到近30年研究者才发现它有部分生物学效应并将其应用在临床上。日本学者通过实验将鼠骨折部位血肿取出并移植到其他部位的骨膜后出现了软骨内成骨现象，但这种现象不能排除骨膜作用引起[1]。有学者还通过进一步研究发现将骨折部位的血肿移植到肌肉，也能发生软骨内成骨，其同时提出不同时期血肿的成骨能力是存在差异的[2]。Grundnes等[3]同样提出相同的观点，通过不同时间点清除骨折部位血肿来观察其对骨折愈合的影响，还指出除去骨折后期血肿对骨折愈合影响较大。近年来国内学者们也集中研究骨折部位血肿的功能机制，它也逐渐在临床手术中得到应用，但对于利用机化血肿还是未机化血肿，学者们持不同观点。郭洪旺等[4]术中将骨折断端处性状为凝块性和肉芽性血肿进行再次应用，术后复查影像学提示骨痂量多且提前出现。褚鹏飞等[5]则创新性地通过凝血海绵将骨折部位血肿由液体转化成固体进行利用。李贵涛等[6]甚至还把骨血肿凝块进行冷藏后再回置入兔骨缺损区。故大多数学者是利用机化后血肿，但是也有少数学者只收集液性血肿进行应用[7]。目前国内对血肿的利用形式主要通过保存再次利用，其他形式相对较少，有些还停留在动物实验上，国内有学者通过从兔骨折血肿中培养出细胞用于自体移植或异体移植修复尺骨骨折[8-9]。有学者还通过抽取自体上肢静脉血注入患者骨折间隙内，形成人工血肿，在治疗骨不愈合上成效显著[10]。但这种人工形成的血肿并不是骨折部位最原始的血肿，其作用机制可能不太一样。
2 骨折部位血肿相关成分及其作用机制
目前研究认为骨折血肿中提供了成骨潜力细胞、炎性细胞、免疫细胞等成分，有骨诱导因子和细胞外基质等提供环境因素及支架功能。事实上，任何肌肉骨骼组织成功修复离不开细胞、环境和支架。
2.1 骨折血肿内存在成骨潜力细胞
前文所述有学者从骨折部位血肿培养出血肿细胞，但其未明确指出这种细胞的来源。Oe等[11]利用流式细胞仪对这种细胞表面标志物进行分析，提示有CD29、CD44、CD105和CD166表达且该细胞在体外能分化成骨细胞、软骨细胞；再通过评价其组化及进行相应的RT-PCR分析，该学者认为这种细胞表现出的特征类似于骨髓来源的间充质干细胞。张宪等[12]也通过实验证实经荧光免疫组化染色的间充质干细胞在血肿内增多并逐渐具有成骨细胞表型，且由此类型细胞分化来的成骨细胞均占一半以上。更有研究证实血肿内具有调节间充质干细胞定向分化的转录蛋白分子RUNX2及晚期标记基因SPP1表达明显增加[13]。因此，血肿细胞很可能来源于间充质干细胞，即MSC。它多来源于骨髓、骨膜及邻近组织，也可来自骨折部位以外。段小军等[14]通过在兔外周血管给予绿色荧光蛋白标记的MSC，发现该细胞能从外周血管迁徙到血肿处。然而MSC有多向分化潜能，在骨折愈合过程中分裂、增殖及分化成各种细胞如成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞，参与骨痂构建。而SDF-1/CXCR4通路在MSC趋化、增殖及分化这一过程中具有关键作用。
2.2 骨折血肿内存在多种骨诱导因子
骨折部位血肿存在的骨诱导因子来源广泛，大多数来源于骨折处骨组织及周围组织变性坏死释放及浸润的炎性细胞，还有来自血流传递的生长因子和其他小分子如前列腺素。此外，还有血小板释放的因子。它们之间相互影响，对骨折愈合有协同作用，可刺激血管新生及MSC聚集、增殖，使之转化为成骨细胞，还可促进细胞外基质合成，给骨折愈合提供了必要的生长环境。
2.2.1 TGF-β 研究证实患者骨折血肿内TGF-β浓度要显著高于其血清浓度[15]。它是参与骨改造重建和骨折愈合的调节蛋白，在骨折血肿内出现早，但量较少。它能刺激MSC、成软骨细胞等多种细胞迁徙、增殖、分化。TGF-β还能促进破骨细胞凋亡防止骨痂吸收，促进成骨细胞增殖并使其分泌细胞外基质，但在后期抑制其增殖[16]。研究表明注入外源性TGF-β可使成骨细胞增加Ⅰ型胶原蛋白和其转录因子SP7表达，而减少碱性磷酸酶mRNA表达[17]。TGF-β通路在T细胞活化和骨代谢中也起到重要的调节作用，雌激素可通过此通路防止骨质丢失[18]。此外，TGF-β还能影响其他生长因子合成。有学者收集不同时期骨痂组织进行TGF-β1与BMP-2免疫组化检查，发现两者在骨折愈合中可能存在协调效应[19]。
2.2.2 BMP 研究者发现骨折部位血肿的细胞内可检测到BMP4 mRNA，该基因翻译后表达BMP，而后者是诱导MSC沿着骨系细胞增殖、发育的始动因子[20]。研究证实TGF-β能增加其诱导能力，它与TGF-β联合使用比单一使用更能促进骨折愈合[21]。它与其他因子也被制成各种复合物：如BMP/VEGF复合物，BMP/bFGF复合物。 2.2.3 VEGF 在血肿内缺氧条件下HIF-1α可作为调节因子促进VEGF表达，后者能促血肿内血管新生和长入，而血管的生成是骨折愈合中极其关键的部分。它也受TGF-β、PDGF、BMP、IL-6等因子调控。它还受外力调节，机械性刺激可增强血肿的促血管生成能力[22]。
2.2.4 PDGF 血肿内的PDGF是血小板的裂解产物，它能通过其受体促进MSC增殖[23]。它还能影响胶原蛋白的形成和降解，与TGF-β联合使用也有良好的协同作用。最新研究证实在骨质疏松的鼠中使用携带PDGFB编码基因的干细胞可增强骨强度[24]。
2.3 骨折部位血肿是骨折炎症免疫反应发生的场所，内含有免疫细胞及炎症介质
2.3.1 骨折形成的血肿刺激机体产生炎症免疫反应 血肿内早期的炎症反应属于非特异性免疫，有多种炎性细胞参与，它们能吞噬凝血块、坏死组织和死骨。比如巨噬细胞可分泌多种炎症介质和因子参与骨折愈合过程：Ⅰ型巨噬细胞分泌IFN-γ、TNF-α等促炎介质实现吞噬功能；Ⅱ型巨噬细胞分泌IL-10等抑炎介质，参与组织修复和抑制过度的炎症反应[25]。最新研究发现它与MSC有密切关系，MSC可显著抑制Ⅰ型巨噬细胞产生炎性介质，促进Ⅱ型巨噬细胞产生抗炎介质[26]。此外，MSC可能抑制Ⅰ型巨噬细胞上CD86和MHCⅡ类抗原分子的表达，减弱T细胞对它的免疫原性，以便它迁移至血肿内[27]。
2.3.2 骨折部位血肿中参与和介导炎症反应的炎症介质也很重要 TNF-α是骨折血肿期最主要的炎症介质，它促进其他炎症介质生成并导致瀑布式的炎症级联反应。它不仅诱导MSC迁移和分化，还增强MSC的免疫调节特性并调节软骨细胞凋亡[28]。另外IL-6能促进骨痂的成熟与矿化，研究表明IL-6基因敲除小鼠会出现骨痂成熟和矿化延迟[29]。
2.3.3 骨折部位血肿存在有调节骨折愈合的免疫成分 近年来研究发现血肿内免疫系统成分在骨折愈合中有调控骨吸收的作用，如活化的T细胞可以通过RANKL表达促进破骨细胞生成，CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞则通过细胞间接触或分泌IL-4、IL-10及TGF-β抑制破骨细胞形成[30]。另外，T细胞上CD80/86分子也可抑制破骨细胞分化[31]。
2.4 机化血肿的骨传导作用
骨折血肿内血小板、有机成分和羟基磷灰石等多种物质机化后形成的纤维网状结构可让细胞、毛细血管及周围组织逐渐长入，起到了良好的骨传导作用，这种作用也正是骨折修复过程很重要的方面。
本文讲述了国内外学者对骨折部位血肿的研究进展，阐述了它存在的主要成分及其相关的作用机制。笔者认为血肿是骨折愈合的反应池，提供最原始的骨传导作用，它涉及骨、血管组织再生、免疫系统，包含成骨潜力的MSC、免疫细胞和骨折愈合所需的骨诱导因子等成分。这些成分也是呈动态变化的，能反映骨折修复的进程，影响着愈合的程度。目前对骨折部位血肿的研究利用形式还比较单一，仍有许多相关机制不清楚，此外，血肿内相关成分之间的联合作用机制仍存在很大的空白，还需进一步探索。
参考文献
[1] Mineo K，Mizuno K，Sumi M，et al.Osteogenic potential of hematoma in fracture healing--transplantation of hematoma under the periosteum of the parietal bone[J].Kobe J Med Sci，1988，34（1）：31-47.
[2] Mizuno K，Mineo K，Tachibana T，et al.The osteogenetic potential of fracture haematomaSubperiosteal and intramuscular transplantation of the haematoma[J].J Bone Joint Surg Br，1990，72（5）：822-829.
[3] Grundnes O，Reikeras O.The importance of the hematoma for fracture healing in rats[J].Acta Orthop Scand，1993，64（3）：340-342.
[4]郭洪旺，李裕学.骨折部位血肿手术再利用[J].中国骨伤，2001，14（1）：50.
[5]褚鹏飞，马国栋，孙英伦，等.骨折血肿回收再利用106例临床分析[J].中国医药指南，2013，11（6）：31-32.
[6]李贵涛，李华仁，徐洪章，等.原始骨血肿的骨再生潜能的实验研究[J].骨与关节损伤杂志，2004，19（5）：323-324.
[7]郑航程.骨折血肿采集回注在骨折手术中的应用[J].中国骨伤，2006，19（12）：748.
[8]周文静.兔骨折血肿细胞的体外培养及自体移植以修复尺骨骨折的实验研究[D].福州：福建医科大学，2005.
[9]刘争进.兔骨折血肿细胞的异体移植及其加速骨折愈合的实验研究[D].福州：福建医科大学，2006.
[10]郭运通，冯金顺，李淑芬，等.人工血肿疗法治疗骨折延迟愈合临床体会[J].中医正骨，2000，12（10）：43.
[11] Oe K，Miwa M，Sakai Y，et al.An in vitro study demonstrating that haematomas found at the site of human fractures contain progenitor cells with multilineage capacity[J].J Bone Joint Surg Br，2007，89（1）：133-138. [12]张宪，汪炜，陈伟，等.内源性骨髓间充质干细胞与骨折微环境中的相关趋化因子[J].中国组织工程研究，201317（27）：5070-5079.
[13] Kolar P，Gaber T，Perka C，et al.Human early fracture hematoma is characterized by inflammation and hypoxia[J].Clin Orthop Relat Res，2011，469（11）：3118-3126.
[14]段小军，杨柳，周跃，等.增强型绿色荧光蛋白标记技术对骨折后骨髓间充质干细胞的迁移示踪[J].中国修复重建外科杂志，2006，20（2）：102-106.
[15] Sarahrudi K，Thomas A，Mousavi M，et al.Elevated transforming growth factor-beta 1 （TGF-beta1） levels in human fracture healing[J].Injury，2011，42（8）：833-837.
[16] Maeda S，Hayashi M，Komiya S，et al.Endogenous TGF-beta signaling suppresses maturation of osteoblastic mesenchymal cells[J].Embo J， 2004，23（3）：552-563.
[17] Glueck M，Gardner O，Czekanska E，et al.Induction of osteogenic differentiation in human mesenchymal stem cells by crosstalk with osteoblasts[J].Biores Open Access，2015，4（1）：121-130.
[18] Gao Y，Qian W P，Dark K，et al.Estrogen prevents bone loss through transforming growth factor beta signaling in T cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（47）：16618-16623.
[19] Zhang Y，Jiang L，Man C，et al.Expression and significance of TGF-beta1 and BMP-2 in mandibular callus][J].Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2013，27（24）：1369-1371.
[20]马真胜，胡蕴玉，王臻，等.骨形态发生蛋白基因表达在骨折愈合过程中的定位研究[J].中华骨科杂志，1997，17（8）：45-47.
[21]刘亮，王东.大段同种异体骨移植复合BMP2和TGF-β2对兔桡骨中段骨缺损愈合的影响[J].中国矫形外科杂志，2007，15（9）：702-705.
[22] Groothuis A，Duda G N，Wilson C J，et al.Mechanical stimulation of the pro-angiogenic capacity of human fracture haematoma：involvement of VEGF mechano-regulation[J].Bone，2010，44（2）：438-444.
[23] Fekete N，Gadelorge M，Furst D，et al.Platelet lysate from whole blood-derived pooled platelet concentrates and apheresis-derived platelet concentrates for the isolation and expansion of human bone marrow mesenchymal stromal cells：production process，content and identification of active components[J].Cytotherapy，2012，14（5）：540-554.
[24] Chen W，Baylink D J，Brier-Jones J，et al.PDGFB-based stem cell gene therapy increases bone strength in the mouse[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（29）：3893-3900.
[25] De Paoli F，Staels B，Chinetti-Gbaguidi G.Macrophage phenotypes and their modulation in atherosclerosis[J].Circ J，2014，78（8）：1775-1781.
[26] Francois M，Romieu-Mourez R，Li M，et al.Human MSC suppression correlates with cytokine induction of indoleamine 2，3-dioxygenase and bystander M2 macrophage differentiation[J].Mol Ther，2012，20（1）：187-195.
[27] Maggini J，Mirkin G，Bognanni I，et al.Mouse bone marrow-derived mesenchymal stromal cells turn activated macrophages into a regulatory-like profile[J].PLoS One，2010，5（2）：9252-9252.
[28] Al-Sebaei M O，Daukss D M，Belkina A C，et al.Role of Fas and Treg cells in fracture healing as characterized in the fas-deficient （lpr） mouse model of lupus[J].J Bone Miner Res，2014，29（6）：1478-1491.
[29] Yang X，Ricciardi B F，Hernandez-Soria A，et al.Callus mineralization and maturation are delayed during fracture healing in interleukin-6 knockout mice[J].Bone，2007，41（6）：928-936.
[30] Zaiss M M，Axmann R，Zwerina J，et al.Treg cells suppress osteoclast formation：a new link between the immune system and bone[J].Arthritis Rheum，2007，56（12）：4104-4112.
[31] Bozec A，Zaiss M M，Kagwiria R，et al.T cell costimulation molecules CD80/86 inhibit osteoclast differentiation by inducing the IDOtryptophan pathway[J].Sci Transl Med，2014，6（235）：235-260.
